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肿瘤学
CRISPR/Cas9介导的PD-1基因敲除对食蟹猴T细胞增殖、表型及IFN-γ和IL-2分泌的影响
目的:探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除食蟹猴T细胞PD-1基因对T细胞增殖、表型及IFN-γ、IL-2分泌的影响。方法:设计靶向食蟹猴PD-1基因的g RNA,构建并提取质粒,分离食蟹猴外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),加入质粒DNA,用Lonza 4D电转仪进行细胞转染,转染48 h后用流式细胞术和荧光显微镜技术检测转染效率。提取细胞基因组DNA进行PCR扩增及T7E1酶切鉴定。在人源性CD3抗体和IL-2刺激下诱导食蟹猴T细胞增殖并绘制细胞生长曲线,PI染色流式细胞术检测T细胞的细胞周期及CD4、CD8表达水平,ELISA检测IFN-γ、IL-2的分泌水平。结果:转染48 h后,荧光显微镜下见实验组出现绿色荧光蛋白表达的细胞,其转染效率为(21.6±3.2)%;实验组细胞基因组DNA PCR产物经T7E1酶切显示3条带,出现目的分裂条带(243、197 bp)。与未转染组比较,(1)实验组T细胞增殖缓慢、集落形成时间延迟、细胞体积较小、折光性较弱;(2)实验组处于G0/G1期的T细胞数显著增多(P<0.05)、G2/M期细胞数显著减少(P<0.05);(3)实验组T细胞IFN-γ、IL-2的分泌水平显著升高(均P<0.05),但CD4、CD8表达水平比较差异无统计学意义(均P>0.05)。结论:PD-1基因敲除可使食蟹猴T细胞阻滞于G0/G1期从而抑制其增殖,同时上调了IFN-γ、IL-2的分泌水平。
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中国肿瘤生物治疗杂志
2020年07期
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