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基础医学
CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定
目的:构建C-末端结合蛋白-1(CtBP1)基因RNA干扰(RNAi)的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+),初步鉴定其干扰效果。方法:以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白(EGFP)基因、卡那霉素(Kanr)抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+),在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果。结果:构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA(pGenesil-1-CtBP1-shRNA),经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1(ADR+/+)细胞表达绿色荧光蛋白(EGFP),证实重组质粒己转染入细胞,转染效率达到60%~70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1(ADR+/+)细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论:成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1(ADR+/+)细胞上CtBP1基因表达。为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。
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癌变·畸变·突变
2010年03期
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