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基础医学
大肠杆菌α-溶血素分泌表达系统的构建及应用初探
分泌性表达外源基因是近年来在构建活载体疫苗中常常采用的策略。分泌表达能减轻细菌载体的代谢负担,提高疫苗的免疫效果。引起人泌尿道感染的大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)的α-溶血素分泌系统是目前研究最透彻的革兰氏阴性菌Ⅰ型分泌系统。该系统组成简单,由HlyB、HlyD、TolC三个转运蛋白组成:适用范围广,只要宿主菌的外膜上具有TolC样蛋白,理论上都可以使用此分泌系统构建分泌型活载体疫苗。所以α-溶血素分泌系统是目前应用最广泛的细菌内源性分泌系统。 本研究首先从UPEC菌株J96染色体上克隆了包括上游调控序列在内的α-溶血素分泌系统决定簇序列,利用基因测序和血琼脂平板溶血环生成实验对克隆产物进行了鉴定,结果表明成功获得了序列正确、功能正常的α-溶血素分泌系统基因簇片段。参考以前构建分泌型表达质粒的经验,分别将需要表达的外源基因(ureB-HspA、hIL-6、hspA、trxA)克隆后,将外源基因片段和包含hlyAs、hlyB、hlyD基因序列的hlyAsBD片段与表达载体pQE30连接,构建了系列分泌表达质粒载体及其非分泌的对照表达质粒。经过PCR鉴定、DNA测序、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot印迹实验证实,在E.coli菌株top10中,融合了ureB-hspA融合基因、hIL-6基因和hspA基因的分泌型表达质粒在诱导后可以高效表达外源基因,融合表达的外源蛋白能被分泌至细胞外,在培养液上清中以可溶形式存在,被特异的抗N端组氨酸标签(His-tag)的单克隆抗体检测到。融合了trxA基因的分泌型表达质粒也可以在top10中高表达TrxA蛋白,但没有在其培养液上清中检测到TrxA融合蛋白。系列分泌型表达质粒在E.coli菌株BL21(DE3)中的表达水平很低或不表达。也未能在培养液上清中检测到融合外源蛋白,推测在BL21(DE3)菌株中外源蛋白低水平表达的主要原因在于菌株的表达酶系的差别。菌株的种类和基因型的不同,会对重组分泌型表达系统的功能实现产生很大影响。
硕士论文
《中国人民解放军军事医学科学院》 2004年硕士论文
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