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农业基础科学
对鞘翅目害虫高毒力的Bt cry基因分离克隆和工程菌的构建
鞘翅目害虫是农业、林业上重要害虫。从Bt菌中分离克隆杀鞘翅目 害虫的特异基因,将有效开发利用我国丰富的杀虫基因资源,缩小国内外 在Bt杀虫基因基础研究领域中的差距,为工程菌和抗虫转基因植物的研 制提供新的基因来源。本论文在系统研究对鞘翅目叶甲科害虫高毒力Bt 菌株Bt22和对鞘翅目、鳞翅目高毒力的UV17菌株的生物学特性的基础 上,开展了cry3Aα、cry1Bα基因分离克隆、表达载体构建和高效双价杀 虫工程菌的构建及其杀虫活性测定等项研究,结果如下: 1、系统地研究了国内Bt分离菌株Bt22和UV17的生物学特性。UV17 生长6小时进入对数生长期,生长速率略快于Bt22(8小时),Bt22与已 知标准菌株Btt生长速率相当。Bt22形成2~5μm扁平方形晶体,体积较 Btt大(1~2μm)。UV17形成2μm双锥体形晶体,体积比HD-73等菌株晶 体大。这两种晶体蛋白分子量分别为73.1kDa和140kDa。PCR-RFLP基 因鉴定结果表明Bt22和UV17分别含有单一的cry3Aα、cry1Bα基因。Bt22 含有4种质粒,cry3Aα基因定位于40kb的质粒上。UV17含有8种质粒, cry1Bα基因定位于20kb的质粒上。生化反应和酯酶图谱分析结果表明Bt22 同Bt拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebroinis)和莫里逊亚 种(B.t.subsp morrisoni)一致。UV17酯酶谱带与Bt苏云金亚种(B.t.Subsp. thuringiensis)相同。 2、利用cry3Aα基因PCR扩增产物作为探针对Bt22质粒酶切产物进行 杂交,结果表明Bt22只含有1个拷贝的cry3Aα基因,该基因定位于质粒 中国农业科学院博士学位论文 DNA 3kb的 Hindlll酶切片段上。根据杂交结果分离克隆了cry3Aa全长 基因,完成了亚克隆和 DNA序列测定。该基因编码区全长为 1932 bPS, 编码 644个氨基酸的晶体蛋白,分于量 73.IkDa,等电点为 pHiz.165,属 于弱酸性蛋白。该基因序列己在EMBL、GenBank中登记注册,Accession Number为 AJ23 7900,提交国际 Bt-6-内毒素基因命名委员会后,被正式 命名为cly3Aa7。这是目前国内分离克隆的第一个对鞘翅目害虫高毒力的 Cry基因。 Southern杂交结果表明cryjBa基因作为单一拷贝定位于质粒DNA BarnHI、Sacl、Sail约 10kb的酶切片段上。本研究设计了一对特异性引 物,以UV17质粒为模板扩增了cry1BQ 5-端2058bps片段,将此片段克 隆于pGEM1 Easy载体后,进行序列测定,结果表明在该片段的第 1055 位碱基与已知的cry1Bal基因存在差异,由A变成G,其编码的氨基酸也 由组氨酸(HIS)变成精氨酸(AIg),说明UV17中的Cy1Ba是一种新的基 因。通过计算机分析cry1Bal 2058bps大片段所编码的686个氨基酸组成 的多肽,等电点为出.665,而UV17中CIy1Ba基因所编码的686个氨基 酸组成的多肋等电点为叫.705,HIS和AIg均为碱性氨基酸,它们之间 的替换对整个多肽的酸碱性、等电点影响很小。采用部分酶切方法建立了 UV质粒文库,通过PCR鉴定、筛选,己获得两个含有Cy1Ba基因的 大片段阳性克隆,外源片段分别为 10kb和 9.skb,亚克隆和序列测定研究 正在进行。 3、为便于 Bt Cry基因快速分离克隆、遗传转化和表达研究,本研究将来 自假单胞菌的复制区 1.Zkb DNA片段插入穿梭载体 pHT315ptECO灼的 Aatll位点,成功构建了一种能在苏云金杆菌·大肠杆菌.荧光假单胞菌 (BtECOli-Pfj三种宿主之间穿梭,并能稳定遗传的广宿主载体 pGMll05 2 DS 门.7kbh 该载体携带氨书青霉素(AmP)和红霉素爬r)抗性基因,保留了 pUC多克隆位点,能在三种细菌中正常复制,稳定遗传,在荧光假单 胞菌和 Bt菌株中 48小时稳定性超过90%。 将 cry3Aa7全长基因分别克隆于 pHT315和 pGMll05多克隆位点上, 获得表达载体pHY512(Bt-ECOli穿梭郴 pLF3ll05(Bt-ECOli-刀穿梭)。将 pHY512、pLF3 05分别电击转化 Bt无晶体突变株 BE20和 Bt自然菌株 UV 17中,构建了两种工程菌Biotlll205和Biotllll 75。研究表明带有cry3Aa7 基因的表达载体能在 BE20和 UV菌株中稳定遗传,稳定性达 90o以上。 cry3Aa7在UV17菌株中能正常、稳定表达,蛋白质表达量与其在Bt22中 没有明显差异,表达时间与Bt22 同步,生长曲线变化不大,由此说明外 源基因的导入对 UV生长发育没有不良影响,从而说明自然菌株 UV 17 是一种研究基因表达调控和构建工程菌的优良受体菌。培养基营养组分的 变化对工程菌中双价基因共表达有显著的影响,选择 1/2 LB培养基培养 Bt工程菌 Biotllll75,能保证 cry!Ba和 cry3Aa基因在同一受体菌内均能 正常表达,互不干扰;而在GT、Z氏培养基中虽然cry3Aa7表达正常, 但是cry!Ba表达量极低。cry3Aa
博士论文
《中国农业科学院》 2000年博士论文

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