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生物学
ETEC定居因子CS3对胡萝卜的转化及肠毒素LTB-ST病毒表达载体的构建
ETEC(Enterotoxigenic Escherichia Coli,肠毒性大肠杆菌)是引起腹泻的一种主要病原菌,其主要致病因子是定居因子抗原(Colonization Factor Antigens,CFAs)和肠毒素(Enterotoxin,LT)。它在致病时是通过定居因子蛋白表面结构粘附到肠上皮细胞表面,然后分泌肠毒素致病。一个有效的ETEC口服疫苗必须能够激起抗定居以及抗毒素两方面的免疫反应。如果一个疫苗包含有定居因子抗原和LT肠毒素,则理论上可使服食者免受80%的ETEC菌株的侵害。CS3是ETEC定居因子之一,临床研究结果表明口服CS3可引起免疫应答。本研究期望通过农杆菌转化系统将CTB(霍乱毒素B亚基,可作为佐剂和载体)基因和CTB-CS3融合基因分别转入胡萝卜植株,使CTB和CTB—CS3融合基因稳定整合到胡萝卜基因组内,希望以此获得以胡萝卜为受体的ETEC口服疫苗,使服食者在进食的同时就可获得腹泻免疫。通过研究ETEC定居因子基因对胡萝卜的稳定转化探索了转基因口服疫苗生产的潜在途径,这对国内研究廉价实用腹泻口服疫苗具有重大的理论和实践意义。同时本研究还通过构建LTB—ST融合基因PVX病毒表达载体,并用农感染法转化植物,探索了暂态表达系统生产疫苗的可能性。 在胡萝卜的再生体系建立阶段,从4个品种中筛选出了适合于本实验的2个胡萝卜品种“新透心红”和“AC93”,并确定了它们通过胚状体发生途径的激素条件及培养基类型。“新透心红”品种是通过MS_0+0.1mg/L 2,4-D诱导愈伤组织,然后转到MS_0培养基上诱导胚状体的发生;而“AC93”是通过B_5+0.2mg/L 2,4-D诱导胚性愈伤组织,然后转至B_(50)培养基上诱导胚状体的形成。两品种愈伤组织上发生的胚状体接种到不含激素的基本培养基上后都能长成健康小植株。同时还研究了本实验激素组合条件下胡萝卜胚的发生情况。2,4—D浓度相同KT浓度不同的激素组合随着KT浓度的升高,诱导的胚性愈伤转至不含激素的培养基上后胚状体发生量及发生胚状体的块数都随KT浓度增加而减少,但愈伤组织块的生长量却随KT的浓度升高而增加。 为了对转化苗加以较为严格的筛选,界定了“新透心红”组培过程中各个阶段的 Kan筛选压。把愈伤组织诱导阶段的Kan浓度定为somg/L;愈伤组织继代的Kan浓 度定为100m叭;小植株长根的培养基的Kan浓度定为SOm叭。在所进行的转化实 验中,分别对幼苗进行4oC不同天数的处理,观察抗性愈伤组织的形成情况。其中幼 苗经4aC处理4天,从其下胚轴所获得的抗性愈伤最多,其抗性愈伤组织的诱导频率 为80%,高于其它各处理的抗性愈伤组织的诱导频率。说明外植体的不同生理状态对 农杆菌转化有一定的影响。 以“新透心红,,品种无菌苗的下胚轴切段和农杆菌PBinCTBS为试材进行了共培 养天数的确定。将“新透心红”品种无菌苗的下胚轴切段和农杆菌PBinCTBS分别共培 养ld、3d、sd、7d,以确定本研究中共培养的天数。发现外植体在共培养2一3d四 周出现较明显的菌液时在含有抗生素的培养基上生长良好,所以确定了共培养2一3d 为本实验较适宜的共培养时间。分别研究了胡萝卜不同苗龄(7d、lld、30d)的抗性 愈伤形成率。在相同条件下的转化实验中,发现不同苗龄的外植体的抗性愈伤的诱导 频率基本相同:还进一步研究了胡萝卜同一苗龄不同部位的抗性愈伤形成率,同时用 3Od苗龄(照光3周)的叶柄和下胚轴做转化实验,发现叶柄的抗性愈伤形成率高于 下胚轴的抗性愈伤形成率,进一步的实验发现,由叶柄诱导的苗子的阳性率高于由下 胚轴诱导的苗子的阳性率,此结果和Pawlicki的结论是一致的。 经过PCR一Southem检测以及southem杂交等实验手段初步证明CTB一CS3和CTB 基因己分别整合到部分胡萝卜基因组中去,RT一PCR可分别证明外源基因在RNA的 水平上有初步转录。 另外,构建了LTB一ST的PVX病毒表达载体的重组克隆,并将重组质粒转化 入农杆菌MOG101和LBA4404中,利用农感染法侵染烟草,得到发病的植株,通过 RT一PCR检测了目的基因表达,对利用病毒表达系统表达外源基因作了初步的探索 和研究。
博士论文
《西北农林科技大学》 2003年博士论文

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