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畜牧与动物医学
四川地区鸭肝炎病毒流行病学调查
为更好了解四川地区鸭肝炎病毒流行情况,本研究以从四川地区采集到8份疑似鸭病毒性肝炎病料为材料,开展了病毒的分离鉴定、VP1基因的克隆测序、序列变异分析等几个方面的研究。 1.通过鸡胚尿囊腔接种分离病毒,得到2个病毒分离株,命名为ZJD和ZJM。所分离毒株在48h~84h即可100%引起9日龄鸡胚死亡。死亡鸡胚发育不良,水肿,全身出血,尤其是胚体头部及脚爪。剖检见肝脏充血出血。尿囊液变绿或变黄。对分离毒株经动物回归试验以及鸡胚半数致死量试验测定其致病性,结果发现,分离毒株对1日龄雏鸭致死率均为60%,发病雏鸭自发病起最快可于十几分钟内死亡。死后呈典型角弓反张姿势。解剖后可见主要病变器官是肝脏。肝脏普遍肿胀,边缘钝圆,病变主要为充血、出血,颜色变淡或略带土黄色,表面斑驳,有针尖大小、瘀斑状或弥漫性出血。多数胆囊肿胀,内充满墨绿色胆汁。部分死亡雏鸭肾脏肿大,血管树枝状充血。其余脏器无病变或不明显。ZJD株第5代尿囊液ELD50为10-4.764/0.2ml,ZJM株第5代尿囊液ELD50为10-4.60/0.2ml。分离毒株血凝试验均为阴性。 2.参考GenBank中收录的Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因组序列,利用Primer Premier 5.0、oligo 6.0软件在保守区域设计一对引物,此引物扩增片段包含有VP1结构蛋白全基因组。通过优化反应条件建立RT-PCR检测方法,该方法能从分离毒株中扩增到长度为1341bp的目的片断。通过建立的RT-PCR方法鉴定其余6株未能从尿囊液中分离到毒株的尿囊液,另检测得到一个毒株,命名为NX。对所得到的3个毒株测序后进行遗传进化分析。结果表明,分离毒株与GenBank上已发表的DHVⅠ毒株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为91.0%~99.4%和94.5%~99.2%,证实分离毒株均为Ⅰ型鸭肝炎病毒。分离毒株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为93.7%~96.2%和96.6%~97.9%。经核苷酸同源性分析可知,分离株ZJD与ZZ株同源性最高,为99.4%,与LY0801同源性最低,为93.1%。NX与NA株同源性最高,为96.6%,与5886株同源性最低,为92.2%。ZJM与NA株同源性最高,为99.3%,与5886株同源性最低,为91.0%。由氨基酸同源性分析可知,分离株ZJD与ZZ株、X株以及GFS99株同源性最高,均为99。2%,与A66同源性最低,为94.5%。NX与NA株同源性最高,为97.9%与ZJ株同源性最低,为95.0%。ZJM与NA株同源性最高,为99.2%,与ZJ株同源性最低,为95.0%。基于VP1全基因核苷酸序列及氨基酸序列分别建立遗传进化树谱。结果表明,ZJD株的VP1基因与山东地区的SG株、ZZ株的VP1基因的核苷酸处于一个较小分枝上,亲缘关系最近;NX株与ZJM株的VP1基因处于同一分枝上,且均与福建地区的NA株的VP1基因处于同一较小分枝上,亲缘关系最近。而ZJD株的VP1基因与161-79-V的氨基酸序列处于较小分枝上;NX株与ZJM株的VP1基因氨基酸序列处于同一分枝上,且均与福建地区的NA株的VP1基因处于同一较小分枝上,亲缘关系最近。氨基酸序列与核苷酸序列的遗传进化方面略有些差别。 本研究成功获得了3个毒株,并通过动物回归试验及胚半数致死量试验,表明分离到的毒株对雏鸭有较强致病力。同时对分离毒株VP1基因进行序列比较,发现分离毒株与参考毒株之间同源性较高,表明VP1基因较为保守,目前四川地区鸭肝炎病毒变异程度不大。
机 构:
领 域:
关键词:
硕士论文
《四川农业大学》 2010年硕士论文

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