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消化系统疾病
肝脏靶向性导入TGF-β_1siRNA对急性肝损伤大鼠TGF-β/Smad信号传导通路的影响
目的①改良一种肝靶向性给药途径的体外留置性肝动脉插管动物模型;②构建启动大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的急性肝损伤动物模型;③运用RNAi技术研究TGF-β_1、TGF-β_1R siRNA联合对TGF-β/Smad信号传导通路的干预作用;④比较外源基因进入靶细胞四种方式转染效果差异,建立和评价肝动脉插管给药的优越性。 方法(1)大鼠肝动脉插管并体外留置改良模型的建立:对Lindell肝动脉插管法进行改进,在10倍手术显微镜下,采用特制内径0.5mm导管(由硬膜外麻醉导管加工而成)经胃十二指肠动脉剪口处插入动脉血管内,逆行到达肝固有动脉开口处后留置导管并固定; (2)肝动脉插管留置及假手术5天后的大鼠急性肝损伤模型:在随后的第1天和第5天,分别予25%四氯化碳花生油溶液(CCl_4)6ml/kg体重,腹腔注射,自由饮用水,进食普通颗粒饲料,造成急性肝损伤,第二次四氯化碳48h后处死所有动物; (3)TGF-β_1、TGF-β_1R siRNA联合对TGF-β/Smad信号传导通路的干预实验:针对肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路中的TGF-β_1及TβRⅠ、TβRⅡ分别构建三个不同靶点的siRNA,36只模型鼠随机分为6组,每组6只,分别为模型对照(M)组,TGF-β_1 siRNA干预(T)组,TGF-β_1 siRNA+TβRⅠsiRNA干预(T+R_1)组,TGF-β_1siRNA+TβRⅡsiRNA干预(T+R_2)组,TGF-β_1 siRNA+TβRⅠsiRNA+TβRⅡsiRNA干预(T+R_1+R_2)组,和空白对照(N)组。实验的第5天(第二次CCl_4后约0.5h),将所需导入的siRNA质粒溶于2ml林格氏液,由尾静脉注射导入siRNA 50μg(联合用药的则各为50μg),M组将无关siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液,从尾静脉注射导入;48小时后处死所有大鼠; (4)siRNA质粒四种导入方法的抗肝损伤与抗肝纤维化的疗效比较:30只模型鼠随机分为5组,每组6只,分别为模型对照(M)组、尾静脉直接注射(V)组、脂质体包裹(L)组、流体动力学法(H)组,和肝动脉插管(A)组。在实验的第5天(第二次CCl_4后约0.5h),V组及A组将所需导入的TGF-β_1 siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液,分别从尾静脉及肝动脉插管导入;L组将所需导入的TGF-β_1 siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液后,再加入脂质体LipofectamineTM 2000 250μg(脂质体:siRNA质粒为5:1),室温混合15分钟后,由尾静脉注射导入;H组将所需导入的TGF-β_1siRNA质粒50μg溶于容量占自身体重10%的林格氏液中,经45mm头皮注射针尾静脉10秒内快速注射完毕;M组将无关siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液,从尾静脉注射导入;48小时后处死所有大鼠; (5)各实验组大鼠处死后检测:血清指标ALT、AST、HA;肝组织HE染色病理检测;PT-PCR技术检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β_1、Smad_3、PCNA和TGF-αmRNA表达;免疫组化技术检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β_1、Smad_3、PCNA和TGF-α蛋白的表达。 结果(1)20只大鼠在构建肝动脉插管并体外留置模型实验中,术中2只因胃十二指肠动脉剪口处血管断裂无法插管;1只手术后死亡,成功者17只,成功率为85%。 (2)急性肝损伤大鼠肝组织中TGF-β/Smad信号传导通路的启动实验中,模型组及肝动脉插管组与空白对照组比较:在血清肝功能指标ALT、AST及肝纤维化指标HA上明显上升(P<0.01);通过肝组织HE染色病理观测,肝细胞出现明显炎症、变性、坏死,纤维组织增生等现象;PT-PCR检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β_1、Smad_3 mRNA表达显著增强(P<0.01);免疫组化检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β_1、Smad_3蛋白的表达增强(P<0.05);而模型组与肝动脉插管组比较,在以上指标中差异不明显,无统计学意义(P>0.05);以上表明,通过插管留置或假手术,加上四氯化碳急性损伤,均能成功启动大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路。 (3)TGF-β_1、TGF-β_1 R siRNA联合对TGF-β/Smad信号传导通路的干预实验中,通过实验指标的比较表明:四个治疗组均能有效干预大鼠肝组织TGF-β/Smad信号传导通路,起到抗肝损伤及抑制肝纤维化的效果(P<0.05);T+R_1+R_2组效果最好,T组效果最差(P<0.05);T+R_1组与T+R_2组间差异无显著性意义(P>0.05)。 (4)siRNA质粒四种导入方法的抗肝损伤与抑制肝纤维化的疗效比较实验中,通过实验指标的比较表明:抗TGF-β_1siRNA质粒经过以上四种导入方法转染入靶细胞,均能有效地阻断大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的传导(P<0.05);四种导入方法比较,肝动脉插管组与脂质体包裹组效果相当(P>0.05),但优于尾静脉直接注射组及流体动力学法组(P<0.05),尾静脉直接注射组效果最差(P<0.05)。 结论①大鼠肝动脉插管并体外留置改良模型具有创建技术方法简单、肝损伤性小、成功率高的特点;②致急性肝损伤,启动大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的动物模型能明显观察到肝纤维化过程中关键环节TGF-β/Smad信号传导通路的激活。该模型在评价抗肝纤维化药物及方法时具有耗时少、有效和经济的特点,值得进一步研究;③针对TGF-β/Smad信号传导通路中的TGF-β_1及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)、Ⅱ型受体(TβRⅡ),的siRNA联合治疗对该信号传导通路的干预具有协同作用,联合用药显著高于单靶点用药效果;④siRNA质粒经肝动脉插管途径转染,是一种安全、方便、高效的外源基因肝脏靶向导入转染方法。
博士论文
《中南大学》 2007年博士论文

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