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橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)成虫肠道细菌分子多态性分析及其功能研究
橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)是一种极具危害性的检疫性害虫,其食性广、寄主杂,可危害柑桔、番石榴、杨桃、芒果和瓜类等40多个科250多种水果、蔬菜和花卉,对农业生产造成了很大的威胁。通过研究橘小实蝇成虫肠道细菌多样性,肠道可培养细菌群落结构组成,及肠道细菌对寄主成虫的引诱作用、存活率和寿命的影响,可为探讨肠道菌群对寄主的生理功能和生态学意义奠定基础,为进一步了解寄主与其共生菌的协同进化、物种进化途径提供新的认知,最终为利用微生物防治此类害虫提供新思路。 本研究通过利用16S rRNA基因的PCR-DGGE分析技术研究了橘小实蝇三个种群(实验室正常喂养种群,实验室无菌糖水喂养种群和野生种群)成虫肠道细菌多样性及肠道可培养细菌的群落结构组成;研究了肠道细菌对寄主成虫的引诱作用;肠道细菌通过饲喂菌悬液的方式对寄主实蝇死亡率和寿命的影响。主要研究结果如下: 从橘小实蝇三个种群成虫肠道分离到150种不同细菌遗传型,分属于γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidetes)、黄杆菌纲(Flavobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)等7个不同的细菌纲。在三个种群中,γ-变形菌纲都超过了肠道细菌总数的70%,是肠道的绝对优势细菌种类。此外,我们把每一种群所占比例大于10%的类群也归为优势细菌种类。因此,我们发现放线菌纲为实验室种群的优势细菌种类(所占比例为10.1%),厚壁菌门为野生种群的优势细菌种类(所占比例为12.3%)。而δ-变形菌纲、拟杆菌纲和a-变形菌纲在三个种群中只占据很少的克隆子(每种类群都少于8个克隆子)。在三个种群的150个细菌遗传型中,有3个分类组(文中标记为Unclassified)无法归属于目前已知的细菌类群,这是目前认识不足的一类微生物,可能与橘小实蝇肠道特殊的微环境有关。以序列相似性大于97%的克隆归为相同的细菌种类为标准,三个种群存在一些隶属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的共有菌种,如Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Pectobacterium和Serratia。进一步对三个种群的多样性指数计算及群落结构组成分析表明,三个种群的细菌群落存在显著性差异。其中实验室无菌糖水喂养种群的细菌多样性最低,只有很少的细菌遗传型与另外两个种群共存。而实验室种群和野生种群的细菌多样性相对较高。 从橘小实蝇三个种群成虫肠道600株可培养细菌得到53种不同细菌遗传型,分属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)和芽孢杆菌科(Bacillaceae)等三个科。其中肠杆菌科是肠道可培养细菌最优势的细菌种类。同样以序列相似性大于97%的菌株归为相同的细菌种类为标准,找到了三个种群可培养细菌的共有菌种,结合菌落形态观察和生理生化特征鉴定,确定共有菌种为肠杆菌属5株,克雷伯氏菌属2株,柠檬酸杆菌属1株,泛菌属1株,肠球菌属2株,以及芽孢杆菌属4株。 室内引诱实验发现,所有供试菌株的不同处理发酵液对橘小实蝇均有显著的引诱作用,其中以Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Enterobacter cloacae和Citrobacter freundii四种菌的引诱效果最好。菌悬液离心后的上清液高压灭菌的引诱效果要好于上清液的过滤除菌液和发酵原液。室内引诱效果最好的六种菌进行了野外引诱实验。结果表明:六种菌的引诱效果都好于对照,其中B. cereus和C. freundii引诱到了最多的雌性、雄性和雌性加雄性实蝇,并且除Klebsiella oxytoca(引诱到的雌蝇和雄蝇一样多)外其余五种菌引诱到的雌蝇都多于雄蝇,六种菌的野外引诱结果与室内引诱结果一致。 利用饲喂菌悬液的方法,研究了肠道可培养细菌占多数比例的肠杆菌科细菌和占少数比例的芽孢杆菌对橘小实蝇存活率和寿命的影响。结果表明:实蝇寿命(无论雌雄)不受喂食抗生素的影响。实蝇对上述两类菌的摄取明显地影响自身的死亡率和寿命。总体而言,饲喂蜡样芽孢杆菌对寿命有不利影响,而饲喂肠杆菌科细菌则有利。对比只饲喂20%蔗糖溶液的实蝇,饲喂蜡样芽孢杆菌的实蝇死亡时间显著加快且寿命明显缩短。相反,饲喂肠杆菌科细菌的实蝇则比只饲喂20%蔗糖溶液的实蝇死亡时间平缓,寿命更长。
博士论文
《华中农业大学》 2011年博士论文

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