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生物学
胸膜肺炎放线杆菌质粒的序列测定与分析
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuroplneumoniae,APP)属于革兰氏阴性杆菌,兼性厌氧生长。胸膜肺炎放线杆菌可以引起猪的传染性胸膜肺炎,能引起各个年龄的猪发生急性和慢性感染,以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变。随着规模化养殖的发展,近几年来该病的发生呈上升趋势,造成了很大的经济损失。为了解决这一问题,需要从分子生物学水平更深入地开展研究。 应用碱裂解方法,对APP2、APP7与APP9三株细菌进行质粒抽提,从APP2与APP9中获得了质粒。我们采用EcoRI限制性酶切,胶回收酶切片断、与同样酶切的载体pBS连接,得到的阳性克隆用M13通用引物双向测序。然后用引物延伸(Primer walking)的方法,测定整个质粒的序列。分析结果显示,APP2菌中含有2个大小不等的质粒,分别命名为pAPP2-7与pAPP2-8,大小分别为4.7kb、9.6kb。说明APP2菌中含有两个相容的质粒pAPP2-7与pAPP2-8。 对质粒pAPP2-7和质粒pAPP2-8进行生物信息学分析,包括质粒全序列的G+C含量与重复序列分析;ORF的搜索、ORF的同源性比较、ORF的CDS的功能;以及氨基酸密码子的倾向性分析等。质粒pAPP2-7全长为4722bp,质粒pAPP2-8全长为9569bp,G+C含量分别为31.58%、32.0%。在每个质粒上存在着大小不等的反向重复和正向重复序列,这些重复序列散落分布,遍布整个质粒,可能对质粒的复制起着重要的作用。ORF分析表明,质粒pAPP2-7上存在着三个主要的ORF,分别编码MobA、MobC及Rep蛋白;质粒pAPP2-8上也存在着分别编码Mob-Pre,Rep 3和Transposase 27的3个主要ORF。随后对ORF氨基酸密码子的倾向性进行了分析。 为了构建胸膜肺炎放线杆菌-大肠杆菌穿梭质粒载体,对质粒pAPP2-7 ORF之外的序列BlastN比对、分析,推测质粒pAPP2-7的复制子,包括质粒的复制起始蛋白以及其上游的一段序列,大小为2.7Kb;用一对带有EcoRI酶切位点的引物,PCR扩增该片断,与pMD-18 T载体连接,转化大肠杆菌TG1,氨苄平板筛选,挑取阳性克隆,经酶切和PCR鉴定,获得阳性重组子pAPP2-MD。EcoRI限制性酶切质粒pAPP2-MD,回收酶切产物,与同样酶切的带有大肠杆菌复制原点的Kan~r基因连接,连接产物转化大肠杆菌TG1,挑取克隆子,获得阳性重组子pAPK2,转化胸膜肺炎放线杆菌血清7型受体菌,抽提质粒得到pAPK2,表明质粒pAPP2-7改造成功。为进一步从分子生物学水平研究胸膜肺炎放线杆菌提供了技术支持。
硕士论文
《浙江大学》 2006年硕士论文

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