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有机化工
甾体药物中间体HMPDD的C_(1,2)位微生物脱氢工艺和动力学研究
抗炎甾体激素药物的母核在C_(1,2)位置导入双键后,能成倍地提高其抗炎活性。与化学方法相比,采用微生物法脱氢,具有反应条件温和、专一性强(包括结构专一性和立体专一性)以及转化率高等优点,已成为甾体激素药物生产中的重要反应之一。 倍他米松(Betamethasone),即16β-甲基-9α-氟氢化泼尼松(16β-methyl-9 α-fluoroprednisolone),是目前糖类皮质激素中作用最强的药物之一,其抗炎作用是氢化可的松(hydrocortisone)的35倍,比强的松高10倍,是地塞米松的2.5倍,且副作用小。倍他米松的生产,一般采用剑麻或薯蓣皂素为合成的起始原料。在合成路线中,17α—羟基—16β—甲基—孕甾—4,9(11)—二烯—3,20—二酮(简称HMPDD),经微生物脱氢生成17α—羟基—16β—甲基—孕甾—1,4,9(11)—三烯—3,20—二酮(简称HMPTD),是关键反应之一。该反应可由简单节杆菌催化实现。反应式如下: 论文在对我国甾体药物工业的现状,微生物转化技术在甾体药物生产中的应用,甾体激素的微生物脱氢研究进展,以及新技术的开发等方面加以全面综述的基础上,针对HMPDD生物转化脱氢的研究报道很少,以及在实际生产中存在的转化率偏低等问题,就HMPDD生物转化脱氢的菌种选育,甾体脱氢酶产酶条件,生物转化新工艺以及生物转化的动力学等方面进行了深入的研究。 首先对适用于HMPDD生物转化脱氢的微生物菌种进行了选育。从实验室收集、保藏的15株简单节杆菌中,通过摇瓶转化的方法,进行菌种的初筛,并经过菌种的分离、纯化,得到转化率较高的2-76菌株。以该菌株为出发菌株,采用紫外线诱变处理,并结合Cs~(137)-γ射线辐照的复合诱变处理方法,选育得到了较佳正变株Q4-2-51,其摇瓶发酵的转化率达86.63%,较原始菌株提高了8%。 浙江大学博士学位论文 该诱变株经群体连续传代方式考察,遗传性能比较稳定。 研究中优化了发酵培养基的组成,考察了Q4一2一51菌株产幽体脱氢酶的较佳 工艺条件。通过单因素实验和正交试验优化,确定的较佳培养基组成为:葡萄糖 0.4%,玉米浆1.2%,蛋白陈0.3%,KHZPO40.2%。简单节杆菌产幽体脱氢酶 的最适条件为:接种量20%,培养基初始pH 7.0,摇瓶装量100 ml/250 ml。 HMPDD可诱导菌体产酶,其较适加量为0.05 g/L,且诱导物以在菌体生长初期 加入为好。金属离子cuZ十和Fe3+明显抑制菌体产酶,zn2+和Fe2+对产酶的抑制 作用较弱,c犷+和Mg2+则对产酶有一定的促进作用。培养基中加入适量的表面 活性剂,如泡敌或吐温一80,对产酶有一定的促进作用。 论文还就HMPDD的微生物转化工艺条件进行了研究,得到较佳的转化工艺 条件:接种量巧%,摇瓶装量为100 ml/250 ml,培养基初始pH7.0一7.5,诱导物 加量O.05g/L。试验中选用乙醇作为HMPDD的增溶介质,其最适加量为7%(v/v)。 研究中还探讨了水析投料法促进微生物脱氢反应的机理。较适的底物投料浓度为 0.7%,并且HMPDD以一次性投料为好。转化过程中加入适量的氯化钻、外源 电子受体(辅酶I、辅酶11、维生素K3)或表面活性剂吐温一80,对转化率的提 高均有一定的促进作用。论文首次将培养液稀释转化新工艺,应用于简单节杆菌 催化的HMPDD脱氢过程。研究开发的稀释转化新工艺中选用无菌水为稀释介 质,当稀释比为1:1(v/v)时,HMPDD的转化率与不稀释的原工艺(对照)相近, 故能大大减少转化反应中作为生物催化剂的菌体用量,提高设备利用率,降低生 产成本。此外,还考察了采用超声波分别处理微生物菌体、投料后的菌悬液以及 HMPDD底物(水析料)对转化结果的影响。结合底物超声波处理的培养液稀释 转化新工艺,可使摇瓶发酵转化率高达92.54%。研究发现,超声波处理能有效 地使底物颗粒细化,提高固体颗粒的比表面积,进而提高底物的溶解速率,起到 强化传质的作用。 论文分别采用10L罐、3OOL罐和3T罐,对HMPDD的微生物脱氢工艺进 行了逐级放大试验。10L罐小试中发现,提高转化阶段的通气量,有利于提高转 化速率,缩短转化周期,提高转化得率。转化30h的HMPDD脱氢转化率可达 86.54%。采用300L罐进行了三个批次的转化试验,控制菌体生长和转化阶段的 通气量分别为0.4 VVm和0.3 VVm,搅拌转速为200 r/min,24h时的平均转化 率达到80.32%。3T罐发酵时,控制菌体生长和转化阶段的通气量分别为0.25 VVm和0.2 VVm,搅拌转速为200:/min,六个批次的平均转化率为840%。以 上研究结果表明,HMPDD生物转化反应的放大过程中虽存在一定的放大效应, 但并不严重。 摘要 本文首次研究了简单节杆菌游离细胞催化HMPDD脱氢的反应动力学。考察 了不同投料方式下HMPDD晶体的粒径大小和分布,幽体脱氢酶的稳定性,以及 底物浓度和酶量等对转化反应初速度的影响,建立了相应的动力学模型。并从实 验数据回归分析,得到了有关的动力学参数。模型计算结果与实验数据比较表明, 提出的动力学模型能较好地描述HMPDD的微生物脱氢过程。动力学研究结果为 调控转化条件,提高脱氢酶的催化活性提供了理论依据。 街体的生物转化过程不同于常规的发酵过程
博士论文
《浙江大学》 2004年博士论文
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