手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
有机化工
毕赤酵母木糖还原酶的改造及重组酿酒酵母发酵木糖生产乙醇的初步研究
天然酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能有效利用己糖发酵产生乙醇,但不能利用木糖。木质纤维素水解液中木糖含量丰富,仅次于葡萄糖,因此,促进木糖向乙醇的生物转化是充分利用木质纤维原料,降低乙醇生产成本的关键环节之一。导入表达毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase, XR)和木糖醇脱氢酶(Xylitol dehydrogenase, XDH)基因的重组酿酒酵母虽然可以代谢木糖,但是这些重组菌株发酵木糖能力较弱,主要原因之一是由于XR的活性主要依赖辅酶NADPH,而XDH的活性依赖辅酶NAD+,两者的辅助因子不同导致细胞内电子氧化还原的不平衡,造成木糖醇积累,影响木糖代谢。因此,通过基因工程方法改造XR和/或XDH的辅酶偏好,使XR和XDH利用的辅酶可以相互偶联,这是目前改进重组酿酒酵母发酵木糖生产乙醇的一项探索性研究。 第一部分毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆、突变位点的筛选及原核表达、纯化和酶活检测 根据毕赤酵母木糖还原酶(Pichia stipitis xylose reductase,PsXR)的双辅酶特性(即对NADH和NADPH均有亲和力),对PsXR的基因进行定点突变,获得NADH高亲和力的木糖还原酶(recombination xylose reductase,rXR),改善了因辅酶不同而导致的酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题。克隆了PsXR编码基因xyl1,通过BLAST工具进行同源性搜索,并用生物软件进行序列比对和结构分析,确定突变位点。用融合PCR方法进行定点突变,并在大肠杆菌表达系统中进行融合表达,且对表达产物进行HIS-TAG亲和纯化,分光光度法检测酶活力,计算比活力。酶活力检测和比活力计算显示,三种突变酶对两种辅酶的亲和力在一定程度上都发生了变化。与未突变的PsXR相比,三种突变酶对辅酶NADPH的亲和力均显著下降,突变酶M3对辅酶NADH的亲和力未发生变化,而突变酶M1和M4对辅酶NADH的亲和力显著升高,其中突变酶M1对NADH的亲和力明显提高,对NADPH的亲和力明显下降,其活性主要依赖辅酶NADH,提示K270R位点在XR与辅酶结合中的关键作用。 第二部分酿酒酵母重组菌株木糖发酵初探 利用酵母双杂交系统,将NADH高亲和力的rXR突变基因m1代替xyl1,与木糖醇脱氢酶基因xyl2共转染S. cerevisiae AH109,以转染xyl1和xyl2质粒的重组酵母细胞为对照,构建重组酿酒酵母发酵木糖菌株。重组酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养,HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况。检测结果显示,与转染xyl1和xyl2基因的重组菌株AH-XR相比,含m1和xyl2基因的重组酿酒酵母AH-M的木糖利用率有明显的提高,乙醇得率增加了16%,木糖醇的产生下降了41.4%。结果证实通过蛋白质工程改造的木糖代谢关键酶,可用于酿酒酵母发酵木糖生产乙醇,并且能改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题,有效提高木糖利用率和乙醇产率。
硕士论文
《南京医科大学》 2009年硕士论文

搜 索