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有机化工
拟无枝酸菌ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀转化途径及工艺研究
本实验室拥有自主知识产权的无锡他汀是胆固醇合成途径中限速酶羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp. ST2710)生物转化而成。至今,其转化过程仍存在许多未解之谜。研究中发现转化过程中在洛伐他汀分子结构三位碳相连的甲基上首先加入了一个羟基,即形成带有3-CH_2OH的产物Ⅰ,随后又出现其同分异构体——无锡他汀,两种产物在产量上也存在着此消彼长的关系。因此,无锡他汀的形成存在着几种转化途径可能性。本研究旨在揭示洛伐他汀生成无锡他汀的转化途径并对发酵工艺进行改进。 为进行无锡他汀的转化机理研究,获得较纯的产物是关键。本研究以色谱分离技术为主进行产物Ⅰ的提纯,采用HP 20大孔吸附树脂为吸附剂,对发酵液中的产物Ⅰ进行分离提纯,考察了HP 20树脂的静、动态提纯效果。静态实验表明,非极性树脂HP 20对中间产物Ⅰ的适宜吸附时间为7 h左右,此时吸附容量为28 mg(产物Ⅰ)/g(干树脂)。动态实验显示,适宜的上样浓度为1 g/L,上样流速为1.5 BV/h,当甲醇浓度在50%-60%洗脱,洗脱流速1.0 BV/h时,可获得高纯度产物Ⅰ。经浓缩和冷冻干燥,获得高纯度产物Ⅰ固体,其相对纯度达95%。 以分离提纯的产物Ⅰ为底物进行发酵,发现有无锡他汀生成,初步确定产物Ⅰ为转化过程中的中间产物。为进一步确认转化途径,采用稳定同位素示踪法,以H_2~(18)O取代培养基中一定比例的水,以~(18)O为同位素示踪标记,通过LC-MS检测发现产物5-OH上的氧原子仍是~(16)O,表明该羟基是从产物Ⅰ的3-CH_2OH直接转位而来,即此过程为分子内重排。该结果表明无锡他汀的生物转化是由洛伐他汀羟基化生成产物Ⅰ,后经分子内转位所形成。 在获得了Amycolatopsis sp. ST2710转化机理的基础上,结合洛伐他汀生成无锡他汀的转化途径中不同阶段适宜发酵pH有所不同这一发酵特点,作者首次提出一种两步法发酵工艺以提高无锡他汀产率。即首先由洛伐他汀羟基化生成产物Ⅰ(阶段一,pH 7.5),并利用大孔吸附树脂将其从发酵液中分离提纯,然后改变发酵条件并以产物Ⅰ为底物继续发酵生成无锡他汀(阶段二,pH 5.5)。同时,对无锡他汀形成期的发酵条件进行优化,最终确定了接种量为10%、温度30℃、pH 5.5、摇床转速120 r/min。同时发现亚铁离子、铜离子以及镁离子有利于无锡他汀的形成,通过正交实验确定三种金属离子的添加量分别为1.429、0.040、0.428 mmol/L。研究结果表明,该工艺使无锡他汀的转化率提高了15%,同时缩短了发酵时间。这种发酵模式可以广泛为生成过程中存在关键中间产物或者发酵时间较长的发酵过程研究提供参考。
硕士论文
《江南大学》 2011年硕士论文
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