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生物学
重组肠激酶包涵体的复性、纯化及其新型重组子的构建
肠激酶(enterokinase, EK)是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,可沿胰蛋白酶原序列中(Asp)4-Lys的羧基端切下,从而释放出活性胰蛋白酶。正是肠激酶在体内表现出的这种高度的酶切特异性使其成为当前基因工程领域融合蛋白表达后切割与纯化的重要工具之一。较之目前裂解融合蛋白常用的凝血酶、Xa因子等蛋白酶和溴化氰、轻胺等化学试剂,肠激酶具有非特异性切割少,反应条件宽泛,切割位点在全部识别序列之后,切出的目标产品首位氨基酸可完全忠实于天然蛋白等特点。近年来所做的尝试多是克隆与表达235个氨基酸的具有酶学活性的肠激酶轻链(EK_L)。 本论文的第一部分是对本实验室已构建好的工程菌pET39b-EK_L/BL21(DE3)的蛋白表达、纯化进行研究。先确定了诱导条件:37℃下培养菌体,OD600为0.7时开始诱导,诱导6小时,IPTG终浓度为0.5mmol/L。随后对培养液上清中的目标蛋白进行亲和分离纯化,产量为每100毫升原发酵液中纯化后的目标蛋白肠激酶量为43.65μg,纯化收率8.34%。由于上清液中肠激酶收率不高,本文又对肠激酶包涵体进行变性复性、纯化研究。采用变性上柱、柱上复性方式进行镍离子亲和分离纯化,利用产物N段携带8个相连的组氨酸与金属螯合层析介质中的镍离子的亲和性,应用Ni-NTA金属螯和层析对样品包涵体进行纯化分离。实验结果表明,在变性条件下纯化的样品在柱上不经洗脱,直接用复性液洗涤,可以使肠激酶在得到提纯的同时实现复性。最后优化复性条件,提高收率。经测定包涵体复性后产量可达到470μg,纯化收率可达到20.3%。 第二部分,本论文开创了另一种利用肠激酶蛋白的新思路——构建双质粒系统,让目的融合蛋白在体系中不需要再单独加入肠激酶蛋白就可进行融合蛋白的切割。并针对现在工业化生产中融合蛋白有以包涵体形式和可溶分泌表达形式两种情况,对双质粒系统进行了初步的构建。构建了一个复制子与大多商业化质粒不相同,拷贝数低,不影响目的蛋白大量表达的重组子——pSB3K3- EK_L。将EK_L基因插入到载体pSB3K3中,并就其表达出的肠激酶蛋白的活性影响条件进行了研究,确定了最佳缓冲液PH值为7.5;最佳反应温度为35℃;合理反应的反应时间为2h。
机 构:
领 域:
硕士论文
《天津大学》 2008年硕士论文

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