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生物学
合成植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达
植酸盐是植物储磷的主要形式,单胃动物缺乏内源性植酸酶,因而不能利用植酸磷,已经证实在饲料中添加植酸酶具有多种有益作用,但影响植酸酶应用的主要问题是生产植酸酶的成本太高。本研究首先以A.ficcum NRRL3135株的植酸酶基因序列为模板,根据Pichia pastoris对密码子的偏爱性,设计出适合在Pichia pastoris表达的植酸酶基因序列phyA—as并通过人工合成方式克隆出该基因。步骤包括:植酸酶基因序列的重新设计、酶切位点分析、19对引物(80nt/每个引物)设计与合成、DNA聚合酶反应、酶切和连接反应等,将合成的phyA—as克隆到大肠杆菌载体质粒pBluescript上,构建出重组质粒pBluescript—phyA—as。其次,选择质粒pPICZαA构建酵母重组表达载体,经KpnⅠ+Xhol酶切的1.4kb phyA—as片段与3.6kb pPICZαA片段相连,得到重组表达载体pPICZαA—phyA—as。线性化的pPICZαA—phyA—as电击转化Pichia pastoris酵母细胞(电压:1500V;电容:25μF;电阻:200Ω),筛选Zeocin~+Mut~-表型的Pichia pastoris重组子。对phyA—as的全序列分析、Pichia pastoris重组子SPAN—Ⅲ的PCR和SDS—PAGE鉴定证实phyA—as整合到重组子SPAN—Ⅲ基因组中。摇瓶发酵和甲醇诱导72小时后,重组子P.pastoris SPAN—Ⅲ的酶活力达到105U/ml发酵液。该重组子Pichia pastoris SPAN—Ⅲ已由中国典型培养物保藏中心保藏(CCTCC NO:200005)。 [* 一个植酸酶酶活力单位的定义:在pH5.5,37℃条件下,以8.4g/L植酸钠溶液为底物,1分钟释放1μmol无机磷所需的酶量。]
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第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集
2001年
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