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生物学
Trichoderma reesei细胞铜代谢相关基因研究
铜是土壤中广泛分布的一种重金属。与其他重金属不同,铜是生物体必需的营养成分,然而当铜含量过高时,又会对生物体造成致命的影响。因此,生物体具有精细调控铜的稳态系统。现有研究表明,酵母菌吸附铜机制大致过程如下:当胞外铜离子浓度升高时,调控因子Tace大量表达,使胞内MT(金属硫蛋白)、GSH、铜锌SOD酶等基因表达相应提高,从而稀释胞内铜离子浓度;当胞外铜离子浓度很低时(<0.01mmoL/L),调控因子Tmae大量表达,从而使跨膜的两个基因Ctr1和Ctr2大量表达,进行高效的铜吸附。在分析了已有的铜吸附相关基因基础上,通过生物信息学方法从里氏木霉(Trichodermreesei)基因组中搜寻到5个可能与铜吸附相关基因:Tctr1、Tctr2、Tctr3、Ttm、Tta。其中前3个基因是功能基因,后2个为调控因子。分别设计含5种不同的铜离子浓度(0.1mmol/LBCS(铜螯合剂)、0mmol/LCu~(2+)、0.01mmoL/LCu~(2+)、0.1mmol/LCu~(2+)、1mmol/L Cu~(2+))的培养基培养里氏木霉,提取RNA以GADPH为内参进行半定量PCR。结果表明,Tctr1、Tctr2、Tctr3基因的mRNA只在培养基加入0.1 mmol/LBCS(创造低水平Cu~(2+))或未加入Cu~(2+)的情况下表达,而当培养基加入Cu~(2+)超过0.01mmol/L时,mRNA表达受到抑制,说明这3个基因可能是里氏木霉调控胞内Cu~(2+)浓度平衡的重要基因。Ttm mRNA仅在培养基中加入0.1mmol/LBCS时有微弱表达,而Tta mRNA在培养基加入铜离子螯合剂和不加入铜离子条件下能高度表达,但当加入铜离子浓度超过0.01 mmol/L下不表达。本研究为进一步揭示木霉菌细胞耐受或吸附铜离子机理奠定了分子基础。通过ATMT同源重组敲除技术,从36个突变子中获得5个Tctr3基因敲除子。分析敲除子的生物学性状发现,敲除子与野生菌在生长速度、产孢情况、色素产生等方面无差别。敲除子与野生菌分别培养在上述5种不同铜离子浓度的CY平板上,发现两者生物学性状也无差别。推测里氏木霉调控铜代谢基因可能不止一个。因此,下一步研究重点将放在两个方面:一是通过基因功能分析,确定低浓度铜离子胁迫和高浓度铜离子胁迫下不同离子通道调控相关基因表达规律和相互关系;二是比较高效吸附铜离子ATMT突变株和野生株在上述铜离子代谢相关基因表达上的差异;三是重要铜离子代谢调控基因亚细胞定位研究,同时通过Western blot测定不同铜离子浓度下基因的表达水平,从而验证基因的功能。
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粮食安全与植保科技创新
2009年

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