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基因重组HBV联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV作用及HBV包装细胞系的构建

孙殿兴;胡大荣;邬光惠;胡学玲 100700;李娟;范公忍

  目的 探讨HBV作为基因治疗载体的可能性并检验其联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV的作用。方法 在表达完整HBV颗粒的质粒上,经基因修饰后联合表达S区反义RNA和核心-P蛋白的融合蛋白,整合于具有HBV复制的2.2.15细胞,形成细胞克隆,ELISA 法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。HBV全基因经删除包装信号ε区后,插入到G418抗性PCI-neo载体,转染HepG2细胞系,用G418筛选形成细胞克隆,检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系,进一步转染表达复制缺损型HBV的质粒,经两种抗生素同时筛选,PCR方法观察上清液中的病毒。结果 2.2.15-pMEP4组、2.2.15-CP组、2.2.15-SAS组和2.2.15-CPAS组,对HBsAg平均抑制率分别为2.74%±3.83%、40.08%±2.05%(t=35.5,P<0.01)、66.54%±4.45%(t=42.3,P<0.01)和73.68%±5.07%(t=51.9,P<0.01);对HBeAg平均抑制率分别为4.46%±4.25%、52.86%±1.32%(t=36.2,P<0.01)、26.36%±1.69%(t=22.3,P<0.01)和 59.28%±2.10%(t=39.0,P<0.01);对 HBV复制的抑制率分别为0、82.0%、59.9%和96.6%。在各治疗组培养上清液中均能检测出重组HBV颗粒。证明包装细胞系具有HBSAg和HBcAg表达,pMEP-CP……