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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的克隆化研究

王春花;成军;郎振为;刘妍;王建军;杨倩;纪冬;党晓燕

  目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术筛选乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白 (HBxAg)反式激活基因 ,克隆HBxAg反式激活相关靶基因。方法 以HBxAg表达质粒pcDNA3 .1(-)X转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与PGEM Teasy载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析 ,发现其中之一为未知基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对 ,电子拼接成功 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷信号序列 ,初步确定新型基因序列。从转染了pcDNA3 .1(-)X的HepG2细胞提取总RNA ,以RT PCR技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序加以证实。结果 发现的新基因命名为XTP3 ,在GenBank中注册 ,注册号为AF490 2 5 2。XTP3基因的编码序列全长为 10 2 0个核苷酸(nt) ,编码产物由 3 40个氨基酸残基 (aa)组成。结论 应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆HBxAg反式激活新型靶基因XTP3 ,为进一步阐明HBxAg反式调节作用及其……   
[关键词]:乙型肝炎病毒;X蛋白;反式激活;基因克隆化
[文献类型]:期刊
[文献出处]: 《胃肠病学和肝病学杂志2003年03期
[格式]:PDF原版; EPUB自适应版(需下载客户端)