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博尔纳病病毒多种检测方法的比较和细胞水平研究

徐鸣明

   背景和目的 新发病毒感染疾病是本世纪对人类公共卫生的新挑战,面对突如其来的大规模爆发性新发病毒感染,我们经常束手无策。如果能够在已知的有可能爆发感染的病毒中预先了解病毒的感染机制、预测其爆发的可能性、构建可靠而有效的病毒检测体系以及治疗措施,这些疾病是可以被预防和控制的。 博尔纳病病毒(Borna Disease Virus,BDV)属于中枢神经系统感染的新发病毒。一百多年前首次在德国发现时,BDV曾经导致大量马匹发生爆发性脑炎而死亡,因而被认为是烈性病毒。人类中发现的BDV感染病例,引起的是慢性的潜伏感染和精神行为异常。由于BDV有在动物中爆发的先例,不能排除其通过自然变异引起人群爆发感染的可能。更值得关注的是,今年初Nature报道,BDV的核蛋白基因已经部分整合到人类和部分动物的基因组内,该病毒与人类多种疾病的发病有关。建立完善的检测体系是研究BDV关键的第一步,所以在验证和比较BDV的各种检测方法的基础上,构建不同需要下BDV检测方法的组合预案以及运用这些检测方法研究BDV的感染机制意义重大。 方法 1.将课题组新建立的BDV P40(Neucleoprotein)实时荧光PCR检测方法与早期建立的BDV P24(Phosphoprotein)实时荧光PCR检测方法用持续感染的BDV细胞株进行敏感性、特异性、重复性、稳定性的评估和实际应用。 2.构建BDV磷蛋白转染的细胞模型,建立BDV的原位PCR检测方法,与抗体检测方法比较,并在实时荧光PCR检测呈阳性的样本上进行实际应用。 3.应用ELISA法检测样本的循环免疫复合物(Circulating immune complexes , CIC),并与实时荧光PCR、抗体检测结果进行对比。 4.比较以上各种方法的特点,建立适合于不同需要的BDV检测组合预案。 5.使用原位PCR、ELISA和荧光显微镜在构建的BDV磷蛋白转染的细胞模型上观察BDV P24转染的细胞在转染后各个时期核酸和蛋白的亚细胞定位和表达量。使用MTT检测磷蛋白转染对少突胶质细胞株(Oligodendrocyte, OL)的影响。 结果 1.两种检测方法敏感性、特异性均好,不同批次试剂的检测结果差异较小,加速破坏实验显示试剂对温度的耐受性好。在两种检测方法的实际应用中对临床病人检测阳性率为3.6%(7/198,P24和P40检测方法),对动物检测阳性率为猪4.4%(16/360,P24检测方法)和4.2%(15/360,P40检测方法),马1.7%(9/527,P24检测方法)和1.5%(8/527,P40检测方法)。该检测方法可以作为BDV大规模流行病学调查和实验室研究的可靠工具。 2.在OL细胞磷蛋白转染的细胞模型上,建立并验证了原位PCR检测BDV的方法,并在实时荧光PCR检出阳性的病例的外周血淋巴细胞上进行了实际应用。 3.使用ELISA(针对CIC)检测发现BDV阳性率为36%,高于RNA检测和抗体检测的阳性率。提示我国BDV以携带形式感染的人群远远高出显性的感染人群。 4.通过对以上各种方法的综合比较,建立了针对流行病学调查、临床诊断和感染机制研究的联合检测预案。 5.BDV转染的早期磷蛋白主要分布在细胞核,而后期则分布于整个细胞;磷蛋白的核酸始终分布在细胞核内; MTT检测发现BDV磷蛋白对神经胶质细胞的生长具有抑制作用。 结论 通过比较BDV的实时荧光PCR、原位PCR、抗体、CIC检测方法的特点,根据它们适应的检测范围,建立了不同要求下的BDV检测方法的组合预案。使用相关的检测方法研究BDV的感染机制发现:BDV磷蛋白转染后的亚细胞定位与真病毒感染的过程相似,而且这种转染抑制了OL细胞的生长。……   
[关键词]:博尔纳病病毒;检测;原位PCR;OL细胞;磷蛋白
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:重庆医科大学2010年