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两种小浆果PUTNHX耐盐基因转化及转化体系的建立

刘太林

   为了将耐盐PUTNHX基因导入蔓越莓(Vaccinium Macrocarpon L.)和蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)培育耐盐转基因新品种,本研究以两种小浆果的幼嫩茎段、新梢等作为试验材料,通过不同种类、不同浓度激素的比较试验,分别获得两种小浆果的最佳再生培养基,建立起了两种小浆果的高效再生体系;通过基因转化选择压力卡那霉素、农杆菌浓度、侵染时间、共培养时间和方式等的筛选,建立了两种小浆果的基因转化体系,并通过农杆菌介导的转化将耐盐PUTNHX基因导入了蔓越莓和蓝莓细胞中,获得了再生芽、再生根和完整的转基因植株突变体。主要研究结果如下: 1.蔓越莓再生体系的建立 以蔓越莓的新梢茎尖为外植体,在含有1/2MS+KT0.5mg/L+IAA0.5mg/L的培养基上进行增殖培养28d后最高增殖系数为4.8;以幼嫩的茎段为外植体,在含有MS+KT0.25mg/L+IAA0.5mg/L的诱导分化培养基上培养,28d后最高芽再生率为100%;将蔓越莓芽转接到芽伸长培养基1/2MS+KT0.25mg/L+IAA1.0mg/L上,伸长培养28d后,芽伸长约3cm左右;再转移到诱导蔓越莓生根培养基1/2MS+NAA2.0mg/L上培养35d后,最高生根率为100%。 2.蔓越莓高效茎段基因转化体系的建立 以蔓越莓的幼嫩茎段为材料,取1-2cm长茎段用带PUTNHX基因和表达质粒PBI121的农杆菌侵染,农杆菌侵染浓度为0.4OD_(550)值,浸染后转入无卡那霉素的分化培养基上,在黑暗条件下共培养2d,再转入卡那霉素浓度为50mg/L的芽再生培养基(MS+KT0.25mg/L+IAA0.5mg/L+400mg/L羧苄青霉素)中,经过三次继代,培养60d后获得抗卡那霉素的抗性芽,最高转化率为7.4%。再将抗性芽转入含有卡那霉素的芽伸长培养基中(1/2MS+KT0.25mg/L+IAA1.0mg/L+400mg/L羧苄青霉素)进行伸长培养,28d后转入含有卡那霉素的生根培养基(1/2MS+NAA2.0mg/L+150mg/L羧苄青霉素)中培养、35d后生根,生根2-3周后移栽。本研究首次将调控耐盐基因PUTNHX,导入了蔓越莓,并获得了转基因植株。 3.蓝莓再生体系的建立 以蓝莓的新梢茎尖为外植体,在含有1/2MS+KT0.25mg/L+IAA0.2mg/L的培养基上进行增殖培养,培养28d后最高增殖系数为5.7;再以幼嫩的茎段为外植体,在含有1/2MS+KT0.3mg/L+IAA0.5mg/L的诱导分化培养基上培养,培养28d后芽最高再生率为100%;将蓝莓嫩芽转接到芽伸长培养基1/2MS+6-BA0.25mg/L+IAA1.0mg/L上,伸长培养28d,长至约3cm后,转移到生根培养基1/2MS+NAA2.0mg/L上培养,培养35d后最高生根率为8%。 4.蓝莓高效的转化体系 本试验以蓝莓H28品种的茎段作为试验材料,将带有PUTNHX基因和表达质粒PBI121的农杆菌培养至0.4OD_(550)值后进行伤口侵染,浸染后转入无卡那霉素的分化培养基上,在黑暗条件下共培养2d,再转入含有1/2MS+KT0.3mg/L+IAA0.5mg/L+卡那霉素50mg/L+羧苄青霉素500mg/L的芽分化培养基上培养,经过三次继代培养约60d后获得抗卡那霉素的抗性芽,最高转化率为5.2%。再将抗性芽转入促芽伸长培养基1/2MS+0.25mg/L6-BA+1.0mg/LIAA+50mg/L卡那霉素+300mg/L羧苄青霉素上培养28d后,转接到生根培养基1/2MS+2.0mg/LNAA+ 50mg/L卡那霉素+100mg/L羧苄青霉素上,经过35d诱导生根,获得转基因植株突变体。本试验首次实现将调控耐盐基因PUTNHX,导入了蓝莓。……   
[关键词]:蔓越莓;蓝莓;再生;PUTNHX基因;转化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:天津农学院2010年