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草莓抗坏血酸代谢相关酶基因apx和dhar的克隆、序列分析及其表达模式研究

侯艳霞

   抗坏血酸(AsA)即维生素C,是一种普遍存在于植物组织的高丰度小分子抗氧化物质,它在清除自由基、调控细胞生长和分裂以及抵抗逆境等方面起着非常重要的作用,也是人类维持健康所必需的一种微量营养元素。因此,AsA的含量已成为衡量农产品品质的重要指标,受到人们的广泛关注。分离、克隆与AsA积累和代谢有关的基因,探讨这些基因在植物体内的功能及其表达模式,对进一步认识AsA在植物体内的积累代谢机制,提高植物体内AsA含量以及增强植物抵抗环境胁迫等方面具有重要意义。 本试验以维生素C含量丰富的草莓栽培品种‘丰香’(Fragaria×ananassa cv. Toyonaka)为材料,分离、克隆了AsA代谢途径中两个关键酶基因Faapx-c和Fadhar,并利用生物信息学手段对这两个基因及其编码的蛋白质进行了结构分析和功能预测,同时分析了这两个基因在草莓不同组织及其果实不同发育阶段的表达模式。主要得到了以下研究结果: 1.通过对GenBank上已登录的几种植物apx和dhar同源基因进行比较,分别在其保守区设计一对引物,扩增得到了草莓‘丰香’apx和dhar基因的中间片段。在此基础上,通过RACE技术扩增得到了包括3’端全长的apx基因序列,命名为Faapx-c;该序列长1034 bp,包含一个长753 bp的完整ORF,编码1个由250个氨基酸残基组成的蛋白质,预测分子量为27.359 kDa,等电点为5.92;3’端非编码区长248 bp,含有加尾信号aaataa和长28bp的poly(A)尾巴。通过SON-PCR技术,从草莓‘丰香’中分离了dhar基因编码区全长DNA序列,命名为Fadhar;该序列长1374 bp,包含一个长887 bp的完整ORF,编码区被3个内含子阻断,该编码区编码1个由190个氨基酸残基组成的蛋白质,预测分子量为20.987 kDa,等电点为6.24。 2.对草莓Faapx-c和Fadhar基因与其它植物apx和dhar基因进行同源比较分析表明,草莓Faapx-c和Fadhar基因序列与其它植物apx和dhar基因的同源性较高,核苷酸序列同源性分别达到65%和62%以上,氨基酸序列同源性达到79%和57%以上,都是比较保守的基因。 3.采用Bioedit软件分析了草莓Faapx-c和Fadhar基因全CDS序列的碱基组成,结果表明:Faapx-c基因碱基A、C、G、T的数目分别是171、200、201、181,四种碱基分别占总数的22.71%、26.56%、26.69%和24.04%,A+T的含量(46.75%)低于G+C含量(53.25%);Fadhar基因碱基A、C、G、T的数目分别是144、125、147、157,四种碱基分别占总数的25.13%、21.82%、25.65%和27.40%,A+T的含量(52.53%)高于G+C含量(47.47%)。草莓Faapx-c和Fadhar基因CDS编码区密码子使用偏爱性分析表明,两个基因都偏向使用以T结尾的密码子。Faapx-c基因含有5个大肠杆菌稀有密码子,而且它们是分散的;而Fadhar基因只含有1个大肠杆菌稀有密码子。 4.采用Bioedit软件及ExPASy在线蛋白质分析软件的ProtParam工具分析了FaAPX-c和FaDHAR蛋白的理化性质,表明FaAPX-c和FaDHAR都是亲水性强、结构稳定的蛋白质。应用ANTHERWIN5.0软件和PredictionProtein服务器预测了FaAPX-c和FaDHAR蛋白的二级结构,结果表明FaAPX-c和FaDHAR蛋白二级结构都是主要以a-螺旋和无规则卷曲两种形式出现。采用EsyPred3D和CPH models-3.0分别构建了FaAPX-c和FaDHAR蛋白的三维结构模型。由ESyPred3D构建的FaAPX-c肽链三维模型中只有12个α-螺旋;而由CPH models-3.0构建的FaAPX-c肽链三维模型中有12个α-螺旋和2个β-折叠。FaDHAR肽链用ESyPred3D构建的三维模型由7个α-螺旋、2个β-折叠和1个转角组成;而用CPH models-3.0构建的三维模型由8个α-螺旋、3个β-折叠和1个转角组成。采用Swiss-Pdb Viewer对FaAPX-C和FaDHAR蛋白的两种模建结果进行了检测,计算得出了它们对应的Ramachandran图,结果表明所得到的三维结构模型都是可靠的。 5.采用网络服务器对FaAPX-C和FaDHAR蛋白的功能进行了预测,结果表明,FaAPX-c属于植物过氧化物酶家族,它的氨基酸序列中存在两段保守的多肽序列,即过氧化物酶活性位点序列(APlmLRLaWHSA)和过氧化物酶近端血红素配体序列(DIVALSGGHTL); FaDHAR属于谷胱甘肽-S-转移酶家族,其氨基酸序列中也存在两段潜在谷胱甘肽S-转移酶的特征序列。FaAPX-c和FaDHAR蛋白都没有信号肽,都不属于分泌性蛋白,也不存在卷曲螺旋结构,而且都没有跨膜结构,都不是跨膜蛋白,没有N-糖基化位点,但都存在多个潜在的O-糖基化位点和磷酸化位点。对apx和dhar基因的电子表达谱分析表明,apx和dhar基因在所能检索到的植物不同部位都能够表达,说明它们在植物生长发育中具有重要功能。 6. Faapx-c和Fadhar基因的表达模式分析表明,这两个基因在草莓‘丰香’不同组织部位都能够表达,在果实中表达量最大。Faapx-c基因在草莓‘丰香’果实不同发育阶段的表达基本是从小绿期开始呈阶梯式的增大,可能与果实生长发育相关;Fadhar基因在草莓‘丰香’果实整个发育过程中高度表达,该基因的表达可能调控着草莓果实内AsA的积累水平。……   
[关键词]:草莓;抗坏血酸代谢;apx;dhar;基因克隆;序列分析;表达
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:四川农业大学2010年