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高产γ-氨基丁酸红曲菌种培育及深层发酵关键技术研究

叶砚

   γ-氨基丁酸(GABA)是一种广泛分布于动植物、微生物体内,天然存在的非蛋白质氨基酸。在动物体内,GABA主要作为一种抑制性神经递质存在,参与脑循环生理活动,具有降低血压、促进生长、治疗癫病、抗衰老、促进采食行为、预防肥胖、促进生殖、肝功能活化等多种功能,在食品和药品工业中被广泛使用。 本文从自然环境中分离到一株红曲菌27号,通过诱变、培养基组分优化、发酵条件优化提高GABA产量,基于小试优化数据完成产业化中试。 首先,从红曲米、红腐乳、酒曲、豆瓣酱中分离红曲菌300株,通过改良纸层析法进行初筛,其中一株27号菌株的GABA产量为2.32g/L。通过形态学手段鉴定其为红色红曲菌(Monascus ruber),并确定其为今后诱变实验的出发菌株。通过紫外诱变、亚硝酸诱变、氯化钴诱变和亚硝酸-紫外诱变获得一株GABA产量高达3.12g/L的诱变菌株(菌株编号为27-A015),通过连续传代实验(连续20次传代),未出现回复突变,即该菌株具有稳定的遗传性,且生长速度较快,因此采用该株红曲菌株作为后续实验的出发菌株,并命名为红曲菌X27。 其次,使用Plackett-Burman法(P-B法)确定对红曲菌液体发酵生产GABA有重要影响的三个因素分别是温度,pH和通气量。通过爬坡实验确定RSM实验的中心点。利用响应面法实验获得的回归系数,建立回归方程:Y=-209.366+3.435X1+55.945X2+0.103X3-0.059X12-5.135X22-0.0002X32-0.081X1X2-0.001X1X3-0.019X2X3,通过计算获得最优发酵条件为:34℃,pH 5.5,通气量120L/h,一级种子,罐压0.3 MPa,接种量5%,搅拌桨转速200 r/min.优化后的GABA产量达到9.18g/L,比未优化提高74.7%。对红曲菌X27进行碳源、氮源、谷氨酸钠的分批补料研究发现,谷氨酸钠对红曲菌X27的生长有一定的抑制作用,发酵初期的低浓度谷氨酸钠是使得菌体大量生长的关键,缩短延滞期和发酵周期,使得生产成本得到有效的控制。通过对氮源补料优化后,GABA的最高产量为9.91g/L。 最后,利用已经获得的培养基最优配方和发酵罐最优条件,进行红曲菌X27的300L发酵实验,即产业化中试。与小型发酵罐相比,大型发酵罐的氧气利用率提高,容积传氧系数KLa的数值增长相对较慢(随着罐体内装液面的增高,KLa的数值增长速率随之减慢),使得中试需要在小型发酵罐发酵参数的基础上对生产一定的调控。通过实验最终确定,在发酵前期(12 h内,)增加搅拌桨速率,可提高发酵液溶氧量,刺激菌体生长,但搅拌桨转速不可超过250 r/min,以免过大的剪切力伤害菌体。在发酵中期(24 h前后),适量添加葡萄糖能改善发酵罐内pH,抑制pH快速上升对菌体的毒害作用。……   
[关键词]:红曲霉;γ-氨基丁酸;深层发酵;优化;产业中试
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江师范大学2010年