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牛副流感病毒3型山东分离株核衣壳蛋白表达鉴定、多抗制备及应用

史鸿飞

   牛副流感病毒3型( Bovine parainfluenza virus type 3, BPIV3 ),为副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒属(Respirovirus)的成员,是引起犊牛肺炎的主要病原之一,又称为运输热病毒。犊牛肺炎是一种临床常见的疾病,每年都给养牛业造成巨大的经济损失。自然感染BPIV3的牛症状表现变化很大:从无症状的感染到严重的呼吸道疾病。BPIV3感染在世界范围内流行,尤其是美洲和亚洲,不断有BPIV3感染的报道。目前我国对该病的研究较少,也没有相关的诊断试剂。 牛副流感病毒3型至少含有6种蛋白,即核衣壳蛋白(NP)、P、M、F、HN和L等蛋白,其中NP蛋白含有病毒的主要种抗原决定簇和属抗原决定簇,能够诱发机体产生强有力的免疫。本研究参照已发表的牛副流感病毒3型(BPIV3)全基因组序列,在NP基因的保守区域设计了套式引物。用牛副流感病毒3型山东分离株抽提的RNA为模板,通过套式RT-PCR扩增了长1534bp的NP基因片段,克隆到pMD18-T载体上。对NP基因的测序结果表明本研究所用的BPIV3山东分离株(SD0835)的NP基因核苷酸序列与目前已报道的BPIV3其它毒株的NP基因核苷酸序列的最高同源率只有84%,利用副流感病毒3型的NP基因核苷酸序列构建的分子进化树分析表明本研究所用的BPIV3山东分离株为一新的基因型,即BPIV3c基因亚型。 将测序鉴定正确的质粒酶切后回收目的片段,定向克隆到pET30a表达载体上,然后转化BL21表达菌,经过IPTG诱导表达,获得了以包涵体形式表达的重组核衣壳(NP)蛋白。利用Ni柱亲和层析法在变性条件下纯化重组NP蛋白,间接ELISA与免疫印迹试验检测表明纯化的重组NP蛋白具有良好的抗原性和特异性。应用纯化的重组NP蛋白包被ELISA板,对采自国内发生呼吸道病牛群的血清进行间接ELISA,结果检测到了阳性血清,检测结果与国外的标准试剂盒进行对比,符合率为92.8%。 利用纯化复性后的重组NP蛋白通过腘淋巴结和皮下接种免疫新西兰白兔,制备了多克隆抗体。间接ELISA和Werstern blotting检测结果表明所制备的多克隆抗体能够识别原核表达的NP蛋白和全病毒蛋白。间接ELISA结果表明重组NP蛋白的兔源多克隆抗体具有很高的效价,当抗体稀释度达到1:8192时,其检测结果仍为阳性。间接免疫荧光试验结果表明重组NP多克隆抗体能够识别牛副流感病毒3型在感染细胞中表达的NP蛋白,而且在稀释度为1:2560时仍具有识别能力。用BPIV3山东分离株接种小鼠,在第2天采取的肝、脾、肺、肾、气管等组织中分离到了病毒,用重组NP蛋白多克隆抗体经免疫荧光试验证实分离毒为BPIV3。 本研究用大肠杆菌成功地表达了BPIV3山东分离株的NP基因,表达的重组NP蛋白具有良好的抗原性,可用于BPIV3血清抗体的检测。用重组NP蛋白免疫新西兰白兔制备的多克隆抗体具有良好的反应性,可以用于BPIV3的鉴定及相关研究。……   
[关键词]:牛副流感病毒3型;NP基因;核衣壳蛋白;表达;多克隆抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2010年