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表达D-甘露糖异构酶的重组大肠杆菌的构建及酶学性质的研究

刘琦

   甘露糖是生产甘露醇的原料,甘露醇广泛应用在医药、食品、化工及生物化学方面。目前兴起的酶法以果糖为原料在D-甘露糖异构酶的催化下直接生成甘露糖,与化学法相比有着成本低廉、能耗低和环保等众多优点。 本文致力于通过基因工程手段,获得表达D-甘露糖异构酶的基因序列,高效重组表达以获取高活性的基因工程菌,并摸索检测方法从而对相关酶学性质进行进一步研究。 首先,从大肠杆菌基因组中克隆D-甘露糖异构酶基因(emi),通过高效表达体系,构建了D-甘露糖异构酶的诱导性表达系统BL21(DE3)/pET30-emi和组成型表达系统pGEMK-HP-emi,诱导型表达体系蛋白大量表达,但表达的包涵体很多,组成型表达体系蛋白表达量很低。 其次,通过放射性土壤杆菌体内D-甘露糖异构酶(fmi)氨基酸序列,结合大肠杆菌编码氨基酸的密码子偏好性,将原基因改造设计为适合在大肠杆菌内表达的fmi基因序列(1245bp)。采用体外基因拼接合成,并构建D-甘露糖异构酶的诱导性表达系统BL21(DE3)/pET30-fmi和组成型表达系统pGEMK-HP-fmi,诱导型表达体系蛋白大量可溶性表达,组成型表达质粒蛋白表达量很低。 最后,通过对检测方法的摸索,采用间苯二酚-盐酸法快速定性检测D-甘露糖异构酶的酶活,采用高压液相色谱法定量检测D-甘露糖异构酶酶活,并对相关酶学性质进行研究。得到以下结论:Emi最适催化pH为7,最适催化温度为45℃,催化25%果糖溶液时,2h可以达到转化平衡25.13%,酶活达到1.57U/ml;Fmi最适催化pH为7.5,最适催化温度为45℃,催化25%果糖溶液时,2h可以达到转化平衡29.2%,催化40%果糖溶液时,2h可以达到转化平衡25.4%。酶活达到5.29U/ml。……   
[关键词]:D-甘露糖;D-甘露糖异构酶;重组表达;基因合成
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:北京化工大学2010年