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表达猪let-7c细胞株的建立及其对猪瘟病毒的调控作用

张旭

   microRNA是一种调节性的非编码小分子RNA,在生命活动中起重要的作用。microRNA一般作用于靶标分子mRNA的非编码区,通过完全或不完全的碱基配对方式抑制靶标mRNA翻译,进而在转录后水平对靶标mRNA进行调控。研究表明,多种病毒都可以编码长生microRNA,同时它在多种病毒感染过程中起着重要的调节作用,推测microRNA在病毒的致病性及病毒与宿主的相互作用方面可能起到一定的作用,那么就很可能对猪瘟病毒(CSFV)的感染起直接的调节作用,这种调节可能是由microRNA与CSFV的3’非编码区相互作用来实现的。通过生物信息预测,发现多种microRNA在CSFV的3’非编码区上有作用位点。为研究microRNA在猪瘟病毒感染中可能起到的作用,本研究构建了绿色荧光蛋白报告系统,以利用绿色荧光蛋白来筛查microRNA在CSFV 3’非编码区的作用位点,建立了表达猪let-7c细胞株,研究了其对猪瘟病毒的调控作用,究获得了以下结果: (1)采用RNA22和miRanda等软件,分别用已知的猪源microRNA和人源microRNA对猪瘟病毒基因组的3 UTR进行扫描,总结了其中可能作用于CSFV基因组上的4条microRNA。设计引物,通过PCR方法扩增出与预期大小相符的片段,与克隆载体pMD18-T载体连接后,经测序鉴定得到ssc-pre-let-7c片段。 (2)根据上述序列设计合成ssc-pre-let-7c片段,并将其连入真核表达载体pGenesil-1.1-dBm2,经酶切以及测序鉴定,方向正确,表明成功地构建了融合ssc-let-7c片段的绿色荧光蛋白报告基因质粒载体;质粒用QIAGENE Plasmid Mini Kit纯化,获得了较高纯度的质粒DNA。 (3)用脂质体转染方法将pGenesil-1.1-dBm2和pGene-let-7c转入猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC);通过G418抗性筛选获得了转染pGenesil-1.1-dBm2和pGene-let-7c的阳性细胞,再由有限稀释法分别获得了转染pGenesil-1.1-dBm2和pGene-let-7c的SUVEC细胞株,细胞株能分别持久转录表达ssc-let-7c。 (4)同时对上述两个细胞株进行接毒试验,用RT-PCR检测细胞株中CSFV的表达量,用MTT比色法检测细胞增殖情况。结果表明,构建的真核表达载体pGene-let-7c可在感染CSFV的SUVEC细胞中有效表达,转染pGene-let-7c的细胞株中,CSFV表达量降低,表明let-7c对CSFV起下调作用;相同条件下,转染pGene-let-7c的细胞增殖低于转染pGenesil-1.1-dBm2的细胞增殖,表明let-7c对CSFV起下调作用。……   
[关键词]:猪瘟病毒;3’UTR;let-7;转染;RT-PCR
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2010年