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农杆菌介导小反刍兽疫病毒H、F基因转化苜蓿的初步研究

刘霞

   本文利用农杆菌介导法,将小反刍兽疫病毒H基因转入苜蓿中,为制备防治小反刍兽疫的转基因牧草疫苗奠定基础。 小反刍兽疫病毒(PPRV)植物表达载体的构建是采用TA克隆的方法,从PPRV质粒中分别扩增出H,F基因,在H基因终止密码子前加入KDEL序列,形成H-KDEL,烟草SRI中扩增出促进外源基因表达的MAR12序列和MAR34序列,pHL005质粒中扩增出报告基因-绿色荧光蛋白GFP基因,以上克隆均带有相应酶切位点,结果显示所克隆的基因和序列均与理论大小相符,说明各种克隆载体构建成功。将GFP基因插入到表达载体pBI121替代GUS基因,便于植物活体组织检测;将PPRV-H、PPRV-H-KDEL基因插入到pBI121-GFP,构建植物表达载体PBI121-GFP-H和PBI121-GFP-H-KDEL;将MAR序列插入到pBI121-GFP基因的一侧,构成中间载体MAR-pBI121-GFP,再将PPRV-H、PPRV-H-KDEL、PPRV-F插入MAR-pBI121-GFP,从而构成植物表达载体MAR-pBI121-GFP-H、MAR-pBI121-GFP-H-KDEL和MAR-pBI121-GFP-F。经酶切、PCR检测上述植物表达载体都构建正确。 成功构建表达载体后,用苜蓿品种甘农1号下胚轴为外植体,通过冻融法将植物表达载体pBI121-GFP-H转入农杆菌EHA105中。并且进一步采用叶片预培养3d,用农杆菌菌液侵染15min,在培养基上铺一层灭菌滤纸共培养3d后清洗,选择压为Km 75mg/L,抑菌浓度为Cef 300mg/L的措施优化了转化体系。在后续的筛选培养后获得具有卡那霉素抗性的愈伤组织,但没有得到抗性植株。经紫外灯照射,没有发现绿色荧光,提取苜蓿愈伤组织基因组的DNA,用PCR鉴定没有得到阳性愈伤组织,今后需要进一步研究。……   
[关键词]:小反刍兽疫病毒;苜蓿;表达载体构建;根癌农杆菌;遗传转化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:青岛农业大学2010年