手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

大肠杆菌双顺反子表达载体中各基因转录与表达水平的研究

李慧

   从20世纪70年代初期基因克隆技术建立至今,短短几十年的时间,基因克隆技术发展十分迅猛,迄今已有很多外源基因被克隆到不同的表达载体中,进行各种研究,以期造福人类[1]。构建多顺反子表达载体,研究原核生物多顺反子不同间隔区对外源基因表达效率的影响,将对多基因共表达具有一定的指导意义。 本研究从大肠杆菌基因组序列出发,对其多顺反子间隔区多种形式和序列进行分析。实验室已有以报告基因――β-半乳糖苷酶(GAL)和绿色荧光蛋白(GFP)基因组成的双顺反子表达载体pET28a-lacZ-gfpD(无间隔序列),pET28a-lacZ- gfpL (间隔序列为起始密码子与终止密码子重迭序列),pET28a-lacZ-gfpR (?-半乳糖苷酶与绿色荧光蛋白融合表达),pET28a-lacZ-gfp15 (间隔序列为pET-32a中T7启动子后的核糖体结合序列)及pET28a-lacZ-gfp51 (间隔序列为lacZ和lacY之间天然间隔区),在此基础上,进一步构建双顺反子表达载体pET28a-lacZ’-gfpL (lacZ加入RBS序列)和pET28a-lacZ’(lacZ加入RBS序列)。将上述质粒和实验室保存的对照质粒pET28a-gfp、pET28a-lacZ和pET28a转化至大肠杆菌Tuner(DE3)中,加入IPTG进行诱导表达,分别以GFP的荧光强度衡量GFP的表达水平,以GAL的酶活力衡量GAL的表达水平,最终用蛋白质电泳进行验证。结果显示,双顺反子表达载体中不同的间隔序列不仅对位于下游的顺反子gfp的表达水平有影响,对位于上游的顺反子lacZ的表达水平可能也有一定的影响,RBS位点有利于下游的顺反子gfp的表达。同时选取pET28a-gfp为研究对象,同一IPTG诱导表达条件下,按时间梯度半定量RT-PCR测定其mRNA水平,RNA转录水平随诱导时间的延长没有明显变化。我们设计的这种双顺反子的表达规律是否适用于其他外源基因,还有待于更多的应用来证实,但至少对于双顺反子载体的构建提供了一个借鉴。……   
[关键词]:大肠杆菌;双顺反子;半定量RT-PCR;β-半乳糖苷酶;绿色荧光蛋白
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:天津大学2009年