手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶对洛伐他汀羟基化的影响及P450酶基因部分克隆

王轩

   他汀类药物属于羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,为降脂药物中的首选药物,也是国内外研究的热点之一。无锡他汀(本实验室拥有自主知识产权)是一种新型HMG-CoA还原酶抑制剂,由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)转化产生。本文主要对Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀的转化过程中的相关酶进行了初步的研究,分析了转化过程中相关酶的酶活与洛伐他汀转化之间的关系,并克隆了该酶的部分基因序列,初步确定该酶为CYP450羟基化酶。 首先,在国内外文献的基础上,确立Amycolatopsis CGMCC No1149 P450酶测定方法为一氧化碳差光谱法,这一方法是根据还原型P450酶与CO结合以后在450nm处有一特征吸收峰的特性建立的。对Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶测定方法进行了优化。主要考察了破壁方法,温度,pH以及缓冲体系对酶活测定的影响。最终确立酶活测定条件:以超声波破碎细胞获得细胞抽提液,温度为室温,缓冲体系为pH 7.4磷酸缓冲液,CO结合时间2 min,紫外分光光度计从400 nm向500 nm扫描。其中波长450 nm处的吸光率即代表了该CYPP450羟基化酶的酶活。 为了判断P450酶与底物羟基化的关系,考察了Amycolatopsis CGMCC No1149 P450酶对洛伐他汀转化率的影响。通过改变培养基初始pH,转化温度,底物浓度,溶氧等因素,考察P450酶活的变化及相应的洛伐他汀转化率的变化。结果发现,pH,温度,底物浓度,溶氧等均对P450的酶活有较大影响,其变化趋势与转化率的变化一致。同时,研究了在添加适量金属离子情况下P450酶活变化情况,其中添加Mg~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)后酶活有显著提高,同时对转化又明显的促进作用。研究结果表明,洛伐他汀的转化跟Amycolatopsis sp.ST2710中的细胞色素P450酶的酶活性密切相关。 通过对所查到的CYP450基因的序列进行分析,利用保守区进行简并PCR,克隆了P450酶基因部分基因片段,其长度为0.52 kb,经序列分析发现其与Amycolatopsis azurea CYP450基因核苷酸序列相似性最高,同源性达到了92%。对该基因片段所编码的氨基酸序列进行了分析,并与其他相关的CYP450氨基酸片段做了同源性比对,发现它们之间的同源性大都超过了60%,为同一亚家族成员。从而在分子生物学的角度初步判断CYP450是Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀过程中的一个相关酶。……   
[关键词]:拟无枝酸菌;洛伐他汀;无锡他汀;微生物转化;CYP450羟基化酶
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2009年
App内打开