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反向重复TuMV HC-Pro基因转化植物的研究

高乃波

   本研究将反向重复的芜菁花叶病毒(TuMV)HC-Pro基因定向插入到植物表达载体pCambia1301上35S启动子下游,并以农杆菌介导的叶盘法转化烟草、拟南芥和雪菜,获得转基因植物。并对转基因烟草的抗病性进行研究。 根据已经发表的TuMV HC-Pro基因序列,设计特异性引物。通过PCR扩增获得部分正反向的HC-Pro基因片段。正向的HC-Pro基因与pGEM-T载体相连,经Xba I, Kpn I双酶切,所得基因片段插到同样酶切开的载体pCambia1301上;反向的HC-Pro基因连入pMD18-T载体,再用Xba I, Pst I双酶切切下,连接到已经插入正向的HC-Pro基因的pCambia1301载体上。鉴定筛选得到含TuMV HC-Pro基因的反向重复植物表达载体pCambia1301-TuMV HC-Pro。三亲交配法将植物表达载体pCambia1301-TuMV HC-Pro转入根癌农杆菌EHA105菌株,得到的阳性转化子用于植物转化。 用农杆菌介导的叶盘法,将反向重复TuMV HC-Pro基因转入烟草,潮霉素抗性筛选获得转基因植株,PCR检测阳性率为93.33 %。对部分烟草植株进行Southern印迹杂交和RT-PCR,结果表明TuMV HC-Pro已整合到烟草基因组。接种60株转基因烟草植株,症状观察和ELISA检测表明,转基因烟草对TuMV表现出四种不同的抗病性类型:(1)免疫型,整个植物在生长过程中无病症,ELISA反应阴性,接种后前五周生长缓慢,节间变短,第六周开始正常生长。(2)抗病型,植物接种后第三周开始发病,第五周病症最严重,第七周开始新生的叶子不发病;节间极度变短。(3)延迟发病型,比非转基因植株延迟一周发病,病症类似。(4)感病型,与非转基因植株一样接种后第三周开始发病,两者病症相似。60株转基因植株中免疫型共2株,占3.33%;抗病型共3株,占5%;延迟发病型,共13株,占21.67%;感病型共42株,占70%。 用滴花法和抽真空法将反向重复TuMV HC-Pro基因转入拟南芥,两种方法的平均转化率分别为1.15 %和0.48 %。潮霉素抗性筛选,共获得30株转基因植株。基因组PCR以及RT-PCR检测表明TuMV HC-Pro已整合到拟南芥基因组,并获得表达。 以雪里蕻(Brassica juncea Coss. var. multiceps Tsen et Lee)子叶、带柄子叶、子叶柄和下胚轴为外植体,在添加不同植物生长调节剂的MS培养基上进行分化培养。结果表明:在4种外植体中,带柄子叶不定芽分化能力最强。子叶和带柄子叶不定芽分化的最适培养基分别为MS + 2 mg/L 6-BA + 0. 4 mg/L NAA + 5 mg/L AgNO3和MS + 2 mg/L 6-BA +0. 2 mg/L NAA + 5 mg/L AgNO3。带柄子叶和子叶不定芽分化的最佳苗龄都为5 d。AgNO3能显著地促进带柄子叶不定芽的分化,以5 mg/L的浓度为最佳。不同基因型对带柄子叶不定芽分化影响不大,但对子叶影响较明显。不定根诱导的最佳培养基为MS+0.2 mg/L NAA。 用农杆菌介导的叶盘法,将反向重复TuMV HC-Pro基因转化雪里蕻,初步构建雪里蕻的遗传转化体系。本论文研究了外植体类型、农杆菌侵染浓度和时间,预培养、共培养和预筛选时间,以及筛选和抑菌抗生素的浓度等对雪里蕻转化效率的影响。结果表明:5 d苗龄的带柄子叶,15 min农杆菌侵染时间,OD600值0.6的侵染浓度,3 d的共培养和预筛选时间,15 mg/L Hyg筛选浓度,400 mg/L Car的抑菌浓度,添加活性碳以及150μg/L AS等条件可提高雪里蕻转化频率。PCR检测,只有1株抗性植株能扩增出500bp大小的条带,与预期转入的HC-Pro基因大小相吻合。……   
[关键词]:芜菁花叶病毒;HC-Pro基因;反向重复;dsRNA;基因转化;抗病性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:杭州师范大学2009年
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