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鱼腥草注射剂过敏反应机制的实验研究

张彬彬

  鱼腥草是一种应用历史悠久的传统中药,具有抗菌、提高机体免疫力、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等作用。鱼腥草的注射剂临床应用广泛,但不良反应较为突出,报道最多的是过敏反应,包括过敏性休克等严重过敏反应,严重危害了患者的健康和生命,同时影响了其临床应用,因此探讨该类药物的过敏反应机制已成为迫切的研究课题。 鱼腥草的注射剂主要包括鱼腥草注射液和注射用新鱼腥草素钠,鱼腥草注射液含48种成分,其中鱼腥草素(Houttuynin,HOU)为其主要药效成分;注射用新鱼腥草素钠仅含单一成分新鱼腥草素(Neohouttuynin,NEO)。两种注射剂所致的过敏反应的发生机制迄今尚无报道,一般认为可能与鱼腥草素和新鱼腥草素有关。因此,本实验重点研究鱼腥草素和新鱼腥草素在鱼腥草注射剂致过敏反应中的作用及机制。 小分子抗原通过与载体蛋白耦联才能诱导机体产生免疫应答反应,用小分子化学物质封闭其与蛋白发生耦连反应的基团可能防止过敏反应的发生。因此,本实验尝试用小分子化学物质封闭鱼腥草素与蛋白发生耦连反应的羟基,检测被封闭后产物的药效,尝试解决鱼腥草注射剂的过敏反应问题。 本实验建立了鱼腥草素和新鱼腥草素致豚鼠过敏反应模型,并探讨了过敏反应的发生机制,以求为过敏反应的防治提供有效措施。 材料与方法 1.鱼腥草素和新鱼腥草素全抗原的制备采用牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)和人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)作为载体蛋白,与鱼腥草素和新鱼腥草素耦连制备全抗原,采用紫外扫描鉴定合成的全抗原。 2.豚鼠过敏反应模型的建立豚鼠40只,体重200g~250g,雌雄各半,随机均分为鱼腥草素组、新鱼腥草素组、阴性对照组和阳性对照组。鱼腥草素组和新鱼腥草素组第1天分别腹腔注射HOU-BSA和NEO-BSA加等量弗氏佐剂,第3,5.天分别注射HOU-BSA和NEO-BSA致敏,于第23天耳缘静脉注射HOU-HSA和NEO-HSA激发;阴性对照组第1天腹腔注射BSA加等量弗氏佐剂,第3,5天注射BSA,于第23天耳缘静脉注射HSA;阳性对照组第1,3,5天注射卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏,于第23天耳缘静脉注射OVA激发。观察激发后过敏反应症状,取发生过敏反应致死豚鼠的肺、肝组织制作病理切片,显微镜下观察。 3.致敏豚鼠血清特异性IgE和IgG抗体豚鼠12只,随机均分为鱼腥草素组和新鱼腥草素组,分别于第11、15、19、23、27、31、35天心脏采血,制备血清备用。采用PCA测定特异性抗体产生的规律,鉴定特异性抗体的类型;采用酶联免疫吸附测定实验(Enzyme-linked immunospecific assay,ELISA)检测豚鼠血清中特异性IgG抗体。 4.肥大细胞脱颗粒和离体回肠收缩实验采用被动肥大细胞脱颗粒实验观察正常豚鼠腹腔肥大细胞(Peritoneal mast cell,PMC)与致敏血清共孵育并用抗原液激发后观察PMC脱颗粒情况并计算脱颗粒率。采用离体回肠实验观察致敏豚鼠离体回肠被攻击后收缩情况。 5.鱼腥草素化学结构的改造为消除鱼腥草素的过敏原性,采用乙二胺封闭鱼腥草素引发过敏反应的羟基,并用抗菌试验测定封闭后产物的药效学变化。 6.鱼腥草注射剂的抗菌效应 鱼腥草注射液的临床常用量为12.6μg·kg~(-1)(以其中鱼腥草素的含量表示),为注射用新鱼腥草素钠的6.3%。本实验探讨了两者临床用量相差较大的原因,以确定其临床应用的合理性。 6.1体外抗菌效应检定菌:金黄色葡萄球菌(G070601-3),河南省药品生物制品检定所;培养基:培养基Ⅱ,按2005版药典配制;方盘制法:将200ml培养基(含0.01%菌原液)平铺于大方盘,以不锈钢打孔器打孔,加样后于37℃培养18h,测定样本抑菌圈直径。 6.2体内抗菌效应小鼠尾静脉注射不同浓度金葡菌菌液,以刚能引起小鼠全部死亡的菌液量作为最小致死量(Minimal lethal dose MLD)菌液。小鼠尾静脉注射MLD菌液制造小鼠感染模型,腹腔注射鱼腥草素、注射用新鱼腥草素钠和鱼腥草注射液进行治疗,对照组注射等体积生理盐水,观察和统计给菌后7天内各组动物死亡率,用Bliss法计算三种药物的ED_(25)。 7.统计学处理应用SPSS10.0软件,对各项数据进行统计学分析。计量资料两组比较分别采用独立样本t检验、配对资料t检验、Spearman相关性检验,检验水准a为0.05。 结果 1.鱼腥草素及新鱼腥草素全抗原的制备紫外扫描图谱显示,耦联产物在280nm处特征性吸收峰明显增强,提示鱼腥草素、新鱼腥草素分别与牛血清蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)耦联成功。 2.豚鼠过敏反应模型的建立鱼腥草素组和新鱼腥草素组豚鼠激发后,部分动物迅速发生呼吸困难、翻滚卧倒、小便失禁甚至死亡等休克症状,两致敏组过敏反应发生率分别为80%和90%,休克发生率分别为20%和50%,死亡率分别为20%和40%。肺组织HE染色显示:两致敏组肺组织淤血,肺水肿合并肺气肿,肺泡壁破坏严重,同时伴有广泛的炎细胞浸润。肝组织HE染色显示:两致敏组肝组织水肿明显,有部分肝细胞胞膜破裂,并伴有炎症细胞浸润。肝肺组织病理变化表明,发生过敏反应致死的豚鼠均呈现典型的过敏性休克特征。 3.致敏豚鼠血清特异性IgE和IgG抗体 采用PCA分别测定鱼腥草素及新鱼腥草素组致敏豚鼠血清抗体产生的规律性,两组豚鼠均是第一次致敏后第15天开始检测出抗体,第23天达到高峰,之后逐渐降低。经独立样本t检验发现,两实验组抗体效价与过敏反应分级均呈显著性相关(P<0.01)。 用加热灭活后的血清致敏24h后激发PCA反应阳性,72h后激发PCA反应阴性,而同时注入体内的非灭活血清72h后激发PCA反应阳性,说明两致敏组豚鼠体内同时存在IgE和IgG型特异性抗体。经Spearman相关性分析,IgE和IgG抗体效价之间无相关性(P>0.05)。 采用ELISA检测了豚鼠血清特异性IgG抗体,鱼腥草素组、新鱼腥草素组和正常豚鼠分别为0.36±0.18、0.51±0.19和0.15±0.07。独立样本t检验结果表明,两致敏组IgG抗体水平均高于正常对照组(P<0.05);经Spearman相关性分析,ELISA所测特异性IgG水平与PCA所测特异性IgG效价之间存在相关性(P<0.05)。 4.肥大细胞脱颗粒和离体回肠收缩实验 致敏血清原液处理并经抗原攻击后,有大量肥大细胞膜不完整,颗粒脱出胞外,阴性对照组、阳性对照组、鱼腥草素组和新鱼腥草素组的脱颗粒率分别为(29.2±6.61)、(70.4±12.5)%、(63.6±7.5)%和(70.8±13.6)%。经独立样本t检验发现,两实验组肥大细胞脱颗粒率均显著高于阴性对照组(P<0.01),与阳性对照组比较无统计学意义(P>0.05)。 鱼腥草素组与新鱼腥草素组的致敏离体回肠经抗原攻击后,肠管收缩明显增强;若在攻击前加入苯海拉明,则离体回肠无明显收缩。 5.鱼腥草素化学结构的改造采用乙二胺封闭鱼腥草素与血清蛋白发生反应的羟基后测定封闭后产物的抗菌活性。结果显示,封闭后的鱼腥草素虽表现为一定的抗菌活性,但抗菌活性较反应前明显降低,说明采用该方法虽可能降低鱼腥草素的过敏原性,但影响其药效的发挥。 6.鱼腥草注射剂的抗菌效应 6.1体外抗菌效应鱼腥草素低浓度组(相当于鱼腥草注射液中鱼腥草素的浓度)与鱼腥草素注射液组均未出现抗菌效应,而鱼腥草素高浓度组(相当于鱼腥草注射液中鱼腥草素浓度的4倍)出现抗菌效应,说明鱼腥草注射液中鱼腥草素的含量较低,体外抗菌活性较差。 6.2体内抗菌效应鱼腥草素、注射用新鱼腥草素钠和鱼腥草注射液的ED_(25)分别为4.58、4.29和0.56 mg·kg~(-1)。结果显示,在达到同样药效(保护25%的败血症小鼠存活)时,鱼腥草注射液的用量仅为鱼腥草素和注射用新鱼腥草用量的12.2%和13.1%。 体外和体内抗菌实验结果提示:鱼腥草注射液中除鱼腥草素外的其它成分在体内也有一定抗菌效应。临床应用鱼腥草注射液时,虽然鱼腥草素的用量较小,但有一定的合理性。 结论 1.鱼腥草注射剂过敏反应的发生与鱼腥草素和新鱼腥草素的过敏原性有关。 2.鱼腥草素和新鱼腥草素所致豚鼠过敏反应的发生与特异性IgG、IgE抗体、肥大细胞等释放过敏介质有关。 3.用小分子化合物封闭鱼腥草素的羟基、以求减低或消除其致敏原性的方法不可行。 4.鱼腥草注射液中除鱼腥草素外,尚含有其他有效成分。……   
[关键词]:鱼腥草素;新鱼腥草素;过敏反应;IgG抗体;IgE抗体;豚鼠
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2008年