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中国野生葡萄APX基因遗传转化拟南芥的研究

张方方

   抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是叶绿体中清除H2O2的关键酶,它可以为各种胁迫所激活。本研究中通过对获得的基因全长进行序列分析,设计引物构建了该基因的过量表达载体和RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,然后通过花絮浸润(folral dip)法转化拟南芥,经抗生素筛选、PCR检测和荧光定量PCR(Real-time PCR)检测获得的T3代转化植株,并对其进行水杨酸(salicylic acid,SA)喷施,研究水杨酸对该基因的诱导作用,另外对转化苗进行盐胁迫处理,研究该基因在盐胁迫中的功能,这为今后分析水杨酸与该基因的相互作用提供了参考,同时也为改善葡萄甚至其它园艺作物抗性提供了有效基因。本研究的主要结果如下: 1、构建了中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因植物过量表达载体和RNA干扰载体 通过BamHI和SalI双酶切,将PWR306-APX中的APX基因全长构建到过量表达载体PWRII中,双酶切鉴定表明,成功构建了中国野生葡萄的APX基因植物过量表达载体。根据APX基因序列设计引物,应用Gateway技术,将该基因片段构建到RNAi载体PHellsgate8中,经酶切检测表明,成功构建了中国野生葡萄APX基因的RNAi载体。 2、研究了中国野生葡萄APX基因转化植株中mRNA的相对表达量 采用folral dip法转化拟南芥,分别用50mg/ml Hyg和40mg/ml Kan对T1代转化植株的种子进行抗性筛选,提取阳性植株的DNA,PCR检测潮霉素基因和APX基因,结果表明,获得了两种拟南芥阳性转化苗。分别提取T3代突变体的RNA,并进行Real-time PCR检测,结果表明,过量表达突变体中的APX基因mRNA相对表达量远远超出野生拟南芥,而RNA沉默突变体中的APX基因mRNA相对表达量低于野生拟南芥。 3、研究了SA对中国野生葡萄APX基因诱导作用 对获得的中国野生葡萄过量表达的拟南芥小苗喷施2mM的SA,72h后分别提取RNA,Real-time PCR分析表明:转化苗和野生拟南芥在SA处理后APX基因mRNA相对表达量均比SA处理前要高,分别是处理前的1.33倍和1.29倍,由此认为SA对中国野生葡萄APX基因具有诱导作用。 4、分析了中国野生葡萄APX基因对拟南芥盐胁迫耐受力的影响 将获得的转基因T3代拟南芥种子和野生型拟南芥种子分别播种于分别含有NaCl浓度为0、100mM、125mM、150mM、175mM的MS固体培养基上,计算其发芽率和根长衡量其抗盐能力,结果显示:在同一处理浓度下,过量表达拟南芥、基因沉默拟南芥和野生拟南芥的发芽率差别不大;随着NaCl浓度的不断增加,三者发芽率均逐渐降低,当NaCl浓度为175mM时,发芽率降低至50%~70%,而且在此浓度下三者生长均受到严重抑制,几乎全是畸形苗;转基因拟南芥和野生型拟南芥均随着NaCl浓度增加根长逐渐变短,而在同一NaCl浓度下,过量表达拟南芥的根最长,根系生长最健壮,而基因沉默拟南芥的根最短最细,野生型拟南芥处中间水平,由此认为中国野生葡萄APX基因可以提高拟南芥盐胁迫耐受力。……   
[关键词]:中国野生葡萄APX基因;过量表达;RNAi;水杨酸;盐胁迫
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2008年