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连香树干旱胁迫过程中的生理变化与基因差异表达分析

麦苗苗

   干旱是主要的环境胁迫因子之一,它严重影响着植物生长和产量。在干旱条件下,许多基因参与了植物对干旱胁迫的响应,然而,目前只有为数不多的基因的详尽功能得到了阐明,并且这方面的大部分工作是在一年生草本模式植物如拟南芥、烟草及水稻上完成的,对林木相关的研究较少。为了研究植物的抗旱机理,发掘抗旱基因,本研究以木本植物连香树为材料,通过抑制消减杂交(SSH)的方法,对连香树在干旱条件下的特异转录组进行研究,结合连香树在干旱条件下种子和二年生幼苗的生理生化变化,对连香树的抗旱机理进行了分析探讨;同时利用抑制消减文库中的差异表达基因片段,采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)方法,对8个差异表达基因片段的表达情况进行分析,验证SSH技术的可靠性。主要研究结果如下: ①以连香树种子为试验材料,研究了不同浓度聚乙二醇6000(PEG 6000)对种子萌发的影响。结果表明:适宜浓度(140~301 g·L~(-1))的PEG预先引发处理连香树种子,能促进种子萌发和芽苗生长,增加渗透调节物质如可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的含量,提高保护性酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,降低丙二醛(MDA)含量,修复膜系统损伤,提高其抗旱性。此外,种子干旱胁迫试验也表明,在干旱胁迫下,伴随PEG浓度的增加,连香树种子萌发和幼苗生长受到抑制,可溶性蛋白含量先升高后降低,可溶性糖、脯氨酸和MDA含量升高,保护性酶SOD和CAT的活性升高及POD活性下降。连香树对干旱胁迫较为敏感,PEG浓度≥95 g·L~(-1)会对种子萌发、芽苗胚轴和胚根生长产生抑制作用。 ②通过采用PEG 6000在室内模拟干旱条件,对二年生连香树实生苗进行干旱胁迫,以研究胁迫对其生理特性的影响。结果表明:随着胁迫浓度的增加和时间的延长,叶片中总叶绿素含量明显降低;在轻度胁迫下(PEG浓度为50~150 g·L~(-1))可溶性蛋白含量上升,而重度胁迫下(200 g·L~(-1))可溶性蛋白含量先升高后降低。伴随PEG浓度的增加,可溶性糖、脯氨酸和MDA含量升高,保护性酶POD活性升高、CAT活性下降,SOD活性先增强后减弱。由此说明,连香树在干旱胁迫下通过增加渗透调节物质含量,降低水势,加强保水力来提高其抗旱能力:并通过增强抗氧化酶活性,提高抗氧化能力,来减轻干旱胁迫伤害。 ③以干旱胁迫处理的连香树芽苗SB_4和未处理的芽苗SB_0,进行抑制消减杂交,构建了共包含768个阳性克隆的正、反向cDNA文库。利用斑点杂交技术进行阳性克隆筛选,共获得差异克隆309个。对309个阳性克隆进行测序,共获得241条uniESTs序列。通过进行BlastX和BlastN分析,有199条ESTs序列与己知功能的基因序列相似,其余的109条与未知功能的基因序列相似。 ④对文库进行Gene Ontology(GO)分类,使我们从不同角度理解199个uniESTs序列在细胞组件、分子功能和生物学途径中的作用。根据这些ESTs所代表的基因的生理生化作用,按功能将其分为13类。其中有103个基因与干旱胁迫关系密切,并对它们进行了分析讨论。连香树的抗旱胁迫过程涉及信号转导与基因的表达调控、渗透胁迫物质的合成、防御反应、转运作用与离子平衡、活性氧清除、救援和防御蛋白合成、修复和保护光合系统等多种途径的综合作用。 ⑤文库提供了大量有关抗旱胁迫基因的相关信息,如海藻糖-6-磷酸合酶(trehalose-6-phosphate phosphatase)、S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethioninedecarboxylase)、G蛋白类(G protein)、钙调蛋白(calmodulin)、钙结合EF家族蛋白(calcium-binding EF hand family protein)、ADP糖基化因子(ADP ribosylation factor)、bZip转录因子(bZip transcription factor)、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(serine/threonine phosphataseprotein)、脂质转运蛋白(lipid transfer protein)、H~+-ATP酶(H~+-transporting two-sector ATPase)、水通道蛋白(aquaporin)、ABC转运蛋白家族(ABC transporter protein)、过氧化氢酶(catalase)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、类金属硫蛋白(metallothionein-like protein)、谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase)、核酮糖1,5-二磷酸羧化加氧酶(Rubisco)、OEE蛋白(oxygen-evolving enhancer protein)、叶绿素a/b结合蛋白复合物(chlorophyll a/b binding protein)、类萌芽素蛋白(germin-like protein)、扩张蛋白(expansin)、胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein)、茉莉酮酸酯诱导蛋白(iasmonate-induced protein)、细胞色素P450(cytochrome P450)和硒结合蛋白(seleniumbinding protein)等,这些ESTs序列的获得,为克隆与分析抗性相关基因奠定了良好的基础。 ⑥选取8个差异表达基因片段,采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行荧光实时定量PCR分析,对SSH结果进验证,结果与抑制消减杂交实验基本一致,表明SSH结果能够正确真实反映被检测基因的表达变化规律,其结果准确可靠。……   
[关键词]:连香树;干旱胁迫;生理生化指标;抑制消减杂交文库;抗旱基因;功能验证;荧光实时定量PCR
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:四川农业大学2009年
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