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猪胰腺弹性蛋白酶原在毕赤酵母中的表达及纯化

张雅军

   弹性蛋白酶(Elastase,ELA)作为丝氨酸蛋白酶,是一种水解不溶性弹性蛋白为特征的广谱蛋白水解酶。由于其广谱的蛋白水解活性,不仅在医疗上有较高的应用价值,而且在食品、日用化工及污水处理等方面也发挥着重要的作用。到目前为止,商业、医药途径获得的弹性蛋白酶主要从猪胰胰腺中提取,受胰腺资源的限制,弹性蛋白酶价格昂贵;同时也不可避免地混杂其它蛋白酶,如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。微生物生产的弹性蛋白酶具有产率高、生产工艺简单、生产成本较低等优点,颇有发展前途。 本研究的目的就是试图通过基因工程的方法利用微生物生产一种高效价廉的重组弹性蛋白酶原产品。根据NCBI GenBank猪胰腺弹性蛋白酶原Ⅱ(proELA2)基因设计一对特异引物,以RT-PCR法从猪胰腺细胞中克隆并得到了含有proELA2基因完整开放阅读框(open reading frame,ORF)的cDNA,将proELA2 cDNA与pTA2克隆载体连接,经测序分析表明与NCBI GenBank中猪胰腺弹性蛋白酶Ⅱ基因序列完全一致。然后将proELA2基因连接到表达质粒pPICZαA得到重组质粒pPICZαA-proELA2,经PmeⅠ酶线性化切开后,通过电穿孔将线性重组质粒整合到毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71染色体上,利用含不同浓度抗生素(Zeocin)的YPDS平板对转化子进行抗性筛选。采用实时定量实时PCR对mRNA表达量高的转化子进行筛选,mRNA表达量高的转化子进行BMGY摇瓶培养后于BMMY用甲醇进行诱导,在醇氧化酶1(AOX1)强启动子的作用下,实现了猪胰腺弹性蛋白酶原在毕赤酵母中的表达,表达产物在α-因子信号肽的引导下成功地分泌到胞外。用Ni Sepharose High Performance亲和层析柱纯化C端-附有6×His的重组蛋白,目的蛋白经SDS-PAGE检测后确定约为32kDa的重组表达产物,与预期目的蛋白产物大小基本相符。纯化蛋白后经Westerenblot分析确定为proELA2目的蛋白,进一步说明重组proELA2在毕赤酵母中获得了成功表达。通过对proELA2在摇瓶培养表达条件的初步探索,得到优化条件:BMGY(pH6.0)培养转化子至OD_(600)值约为3.0时,使用同体积的BMMY(pH6.0)培养基重悬细胞,于29℃,250r/min,每隔24h补加0.75%(v/v)的甲醇,诱导132h,重组酵母KM71/pPICZαA-proELA2表达较好。……   
[关键词]:猪胰腺弹性蛋白酶原;基因克隆;毕赤酵母;基因表达;蛋白纯化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2009年