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猪羧肽酶A1酶原的基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

赵莹

   羧肽酶A(EC 3.4.16)是一类水解蛋白和多肽底物C端芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸残基的消化酶,其添加能改善幼龄动物因消化酶分泌不足而引起的消化问题,因此在养殖业中具有较高的应用价值。然而目前商品羧肽酶A主要由猪胰腺提取、纯化而来,因此要在动物饲料中经济地应用这种酶还面临着相当大的挑战。通过分子生物学方法克隆猪胰腺羧肽酶A1酶原(proCPA1)基因,构建高效表达载体表达proCPA1并且分离纯化目标蛋白,利用基因工程手段大量制备CPA1蛋白具有重要的研究意义和广阔的市场前景。 毕赤酵母表达系统具有易于高密度发酵、表达基因稳定整合于宿主基因组、表达产物能有效分泌并适当糖基化、培养方便经济等特点,经过近十年发展,已成为较完善的外源基因表达系统。在此我们克隆了猪胰腺proCPA1基因并构建了proCPA1的毕赤酵母表达系统,通过甲醇诱导成功表达获得proCPA1蛋白,为下一步大量制备CPA1蛋白提供基础,研究结果如下: 以猪新鲜胰腺为实验材料,用TRIzol法提取胰腺总RNA,采用RT-PCR技术扩增出proCPA1基因的cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体,经测序分析克隆的基因与猪胰腺羧肽酶A1酶原基因序列一致;将proCPA1基因定向克隆到表达载体pPICZαA上,构建了重组表达质粒pPICZαA-proCPA1;重组质粒经PmeⅠ酶线性化后电穿孔法转化毕赤酵母X-33细胞;采用实时荧光定量RT-PCR筛选高RNA表达的阳性转化子用于进一步重组蛋白诱导表达;筛选的阳性转化子于BMGY摇瓶培养后于BMMY用甲醇进行诱导,表达产物经His-Tag Ni亲和层析纯化,得到纯化的蛋白,经SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色分析显示纯化蛋白分子量约为47kDa,与目标蛋白预期分子量大小一致;进一步经肽质量指纹图谱(PMF)以及Western blot分析证实,表达、纯化的蛋白就是重组猪胰腺羧肽酶A1酶原蛋白。 本研究采用毕赤酵母表达系统成功表达了重组猪胰腺proCPA1,为下一步优化诱导表达条件,大量生产应用该蛋白奠定了基础。……   
[关键词]:猪羧肽酶A1;毕赤酵母;基因表达;蛋白纯化;Western blot
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2009年