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弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆、表达及鉴定

曹丽艳

   弓形虫(Toxoplasma gondii)为专性细胞内寄生原虫,能引起人兽共患弓形虫病,严重危害人类健康和畜牧业发展。弓形虫表面抗原1 (surface antigen 1,SAG1)是位于弓形虫速殖子表面的特异性蛋白,也是最早被克隆测序的弓形虫表面蛋白,SAG1因为在诊断和免疫中具有双重价值而得到广泛研究。 根据GenBank数据库中的弓形虫RH株表面抗原1(SAG1)基因序列设计1对引物,应用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增SAG1基因片段,克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-SAG1。测序结果表明获得1011 bp的SAG1基因片段,编码336个氨基酸,与已知的SAG1基因核苷酸序列(序列号S76248)及其编码氨基酸序列的同源性分别为98.9%、97.3%。重新设计一对从SAG1蛋白强抗原表位开始的引物,将SAG1基因片段定向亚克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒pET-SAG1转化至E. coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达。表达产物用SDS-PAGE进行鉴定,结果表明SAG1基因片段在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,分子量大小约为35 kD,Western-blot鉴定结果表明,表达产物可以被羊抗弓形虫阳性血清所识别。重组抗原经纯化和复性后免疫小鼠,间隔两周,免疫三次,最后一次免疫后1W对小鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染。对抗血清进行间接ELISA检测,结果小鼠免疫后产生了较高滴度的特异性抗体,虽然与对照组相比免疫组小鼠存活时间有一定的延长,但差异无显著性。为了获得与天然SAG1蛋白构型接近的重组蛋白,另外设计一对引物扩增SAG1的基因片段。PCR产物经纯化、酶切后定向插入pcDNA3.1真核表达载体,转化至大肠杆菌DH5α,经酶切及PCR鉴定后进行测序。结果表明,从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增出1008 bp的特异SAG1片段,大小与预测值相符。pcDNA-SAG1的成功构建,为进一步在细胞中的表达及弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。……   
[关键词]:弓形虫;表面蛋白1;克隆;免疫原性;真核表达质粒
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:甘肃农业大学2009年