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山羊类胚胎干细胞的分离与培养

李天达

   山羊胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)是克隆动物、转基因动物、制备生物反应器和组织工程等理想的候选细胞,然而至今没有成功建系的报道。本研究选用马头山羊为试验对象,在其繁殖季节,使用CIDR孕激素海绵栓诱导同期发情,使用OVAGENTM进行超数排卵处理,手术法体外冲胚。获取胚胎后参照小鼠和人ESCs建系的方法,系统比较了不同培养条件和传代方法以及血清成分对分离、培养山羊ESCs的影响,并对得到的细胞进行了相关检测和鉴定,主要获得以下结论: 1.应用CIDR阴道诱导同期发情,在撤栓后的24~36h羊只出现发情高峰,0~72h发情率为95.00%。对采用不同剂量的OVAGENTM的三个试验组的山羊进行超数排卵处理,结果表明注射160mg试验组所获得的胚胎数量最多。超排共获得胚胎158枚,其中84枚胚胎鉴定为囊胚、B级以上,可用于山羊胚胎干细胞分离与培养试验。 2.试验以DMEM/F-12+15%KSR+0.1mmol/Lβ-Me+0.1mmol/L非必需氨基酸+2mmol/L谷氨酰胺为基础培养液,添加细胞因子LIF(1000 IU/mL)和bFGF(20 ng/mL),以MEF作饲养层,采用机械法分离囊胚ICM,并利用机械分割的方法进行传代,最高将山羊类ESCs传至6代。最终未能获得稳定传代的细胞系。 3.以DMEM/F-12为基础培养液,研究了含血清和无血清条件下山羊ICM的增殖规律。结果表明,含血清培养可以促进ICM的贴壁和增殖,有利于山羊ESCs的体外传代培养,但也促使细胞发生一定分化。添加FBS的试验组ICM的贴壁率较高。而添加KSR试验组的最高传代数为6代,高于添加FBS的试验组。 4.试验以DMEM/F-12+15%KSR+0.1mmol/Lβ-Me+0.1mmol/L非必需氨基酸+2mmol/L谷氨酰胺为基础培养液培养山羊ESCs。结果表明利用机械法分离ICM。小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层以及联合使用LIF和bFGF和利用囊胚分离适合于山羊类ESCs的分离、培养。 5.试验对分离得到山羊类ESCs进行生物学检测。结果表明所分离的山羊类ESCs具有典型的胚胎干细胞形态特征;碱性磷酸酶染色(AKP)染色检测结果呈阳性;ESCs特异性转录因子OCT-4和Nanog检测结果呈阳性;对其中一株山羊类ESCs进行核性分析,其核型表现为正常的二倍体核型。……   
[关键词]:山羊;超数排卵;胚胎干细胞;分离;培养
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:甘肃农业大学2009年