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Amycolatopsis sp. ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀过程的初步研究

付维来

   他汀类药物属于羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,为降脂药物中的首选药物,也是国内外研究的热点之一。无锡他汀(本实验室拥有自主知识产权)是一种新型HMG-CoA还原酶抑制剂,由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)转化产生。本论文主要对Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀的转化过程进行了初步的研究,分析了转化过程中相关的酶系,并对大量积累中间产物的发酵条件进行了优化。 通过对发酵液中转化产物结构的比较分析,假设了三条可能的转化途径,并对可能的转化途径进行验证分析。通过测定发酵过程中洛伐他汀、产物Ⅰ和无锡他汀随发酵过程的变化趋势,根据产物Ⅰ在发酵过程中的变化情况,初步推测了无锡他汀代谢途径。利用酶抑制剂的手段,阻断了发酵过程中底物向产物的转化过程,通过添加去除洛伐他汀的初步提纯液,发现转化产物Ⅰ对无锡他汀的生成有重要的影响。通过对ST2710转化洛伐他汀生成无锡他汀过程的研究,初步推测出其代谢转化过程:洛伐他汀羟基化生成中间产物Ⅰ,中间产物Ⅰ异构化生成无锡他汀。这为进一步研究无锡他汀的生物转化提供了实验基础。 为了研究在无锡他汀的转化过程,对洛伐他汀羟基化生成产物Ⅰ的转化过程进行了考察。这一过程是由羟基化酶催化完成,因此利用细胞抽提液,建立了测定洛伐他汀转化生成产物Ⅰ的方法:NADH作为辅酶为反应的发生提供必需的H+,催化的最适pH、温度分别为7.5和30℃,150 r/min,催化时间6 h。根据抽提液中的羟基化酶是胞内诱导酶,并可被CO抑制的现象,推测Amycolatopsis sp.ST2710中催化洛伐他汀羟基化的酶是细胞色素P450酶系。ATP、Fe~(2+)和抗坏血酸对催化有促进作用。 为了研究中间产物与无锡他汀的转化关系需提供高纯度的产物Ⅰ,为此对积累产物Ⅰ的发酵条件进行了优化。通过发酵条件优化最终确定了最佳的接种量、温度、pH、摇床转速和底物添加量分别为10%、30℃、7.5、120 r/min和0.8 g/L。研究了金属离子对洛伐他汀转化率的影响,发现Mg~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)对转化率有显著的促进作用。通过正交实验,分析了三种金属离子对发酵水平的影响,已获得最优的转化条件,三种金属离子的添加量分别为0.857、0.040、0.257 mmol/L时,洛伐他汀生成产物Ⅰ的转化率较高。……   
[关键词]:洛伐他汀;无锡他汀;拟无枝酸菌;微生物转化;转化代谢途径;羟基化酶;发酵条件优化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2009年
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