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环介导等温扩增技术检测水稻白叶枯菌方法的建立

湛彦超

   环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出10~9靶序列拷贝,扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物,电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。 本研究针对水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)GeneBank收录号为AF169030的一段序列设计了一套特异性的引物,利用环介导等温扩增技术(LAMP)来扩增Xoo基因组DNA,扩增出一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物,成功建立了LAMP检测Xoo的新方法。该检测方法特异性好、敏感性高而且节省时间。 研究中分别设计了LAMP的不同引物浓度比、Mg~(2+)浓度梯度、温度梯度、时间梯度等实验来优化反应条件,从而获知在内外引物浓度比为1:4、Mg~(2+)添加浓度为4mmol/L、反应温度为63℃且反应时间为60min时检测最灵敏。将LAMP的浓度梯度实验和PCR的浓度梯度实验进行对比,发现LAMP对抽提的Xoo DNA最低检出浓度为46pg/tube,PCR对Xoo DNA最低检出浓度为4.6ng/tube,即LAMP技术的灵敏度是PCR的100倍。此外,LAMP能检测到直接裂解菌液中的DNA,而PCR却检测不到。……   
[关键词]:环介导等温扩增;核酸;链置换反应;内引物;外引物;水稻白叶枯菌
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南昌大学2008年