手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

池蝶蚌外套膜组织学及钙调蛋白基因的克隆和表达特性分析

李云娟

   池蝶蚌(Hyriopsis schlegeli)作为一种引进的优质的淡水育珠蚌,已经广泛应用于我国的淡水育珠产业中。贝类培育珍珠的重要部位是外套膜,然而到目前为止,有关池蝶蚌外套膜的组织学结构的研究还未见有报道,并且对参与和调控淡水珍珠形成的基因研究也属空白。本研究用传统的石蜡切片和H.E染色技术对池蝶蚌外套膜不同部位的组织结构进行了详细的观察,并对不同部位边缘突起的厚度、形状、面积进行了研究,同时成功克隆了池蝶蚌钙调蛋白cDNA的全长序列,并对其表达特性进行了分析。 1、池蝶蚌外套膜的组织结构观察 运用组织学方法对池蝶蚌外套膜不同部位进行了观察。结果表明,池蝶蚌外套膜由边缘膜和中央膜组成,边缘膜包括三个突起,分别是生壳突起,感觉突起和缘膜突起。外套膜不同部位的组织结构基本相同,由外表皮、内表皮、结缔组织和肌肉纤维组成。研究发现不同部位边缘突起的形状、面积等有较大差异,厚度也不同,一般是蚌体中部和中后部较厚。内表皮细胞间分布有三种类型的分泌细胞,分别是嗜碱性粘液细胞、大分泌颗粒细胞和小分泌颗粒细胞。而外表皮上只分布一种空泡状分泌细胞。 2、池蝶蚌钙调蛋白基因的克隆与表达特性分析 钙调蛋白(Calmodulin,CaM)是普遍存在于真核生物体内的小分子钙离子结合蛋白,通过与Ca~(2+)结合,并与靶酶相互作用,参与细胞的多种生理活动。在贝类中,钙调蛋白作为钙离子通道的成员,以及Ca~(2+)-ATPase系统中至关重要的调节者,在钙离子的获取和转运以形成贝壳的调节过程中起着重要作用。根据在NCBI数据库中寻找相近物种的钙调蛋白基因序列,设计引物,利用RT-PCR技术获得钙调蛋白基因的部分序列。同时根据已获得的序列,设计引物,利用SMART RACE技术分别获得3 端序列和5 端序列,拼接后获得池蝶蚌CaM基因的cDNA全长为855 bp,开放阅读框(ORF)447 bp,编码149个氨基酸,预测分子量为16.8 kDa,等电点为4.14。5 非编码区含70 bp,3 非编码区含309 bp,以及一个由26个A组成的poly(A)尾。与其它物种钙调蛋白基因一样,池蝶蚌CaM含有4个EF-hand结构域,每个结构域中含有2个α螺旋和1个钙离子结合区域。经过序列比对发现其氨基酸序列与其它物种具有很高的同源性。 运用荧光定量PCR技术分析检测cam基因在池蝶蚌不同组织中的表达情况,结果表明在池蝶蚌的外套膜、鳃、性腺、斧足、闭壳肌5种组织中均检测到cam基因的表达,但不同组织中其表达量是有显著差异的。以闭壳肌中cam基因的表达量为参照,鳃中cam的表达量最高,是闭壳肌中的106倍;其次是斧足和外套膜,表达量也相当高,是闭壳肌中的60-80倍;性腺中的也高于闭壳肌中的表达。这5种组织中闭壳肌中cam基因的表达量最低。 同时,还运用荧光定量PCR技术分析检测cam基因在不同年龄池蝶蚌外套膜组织中的表达情况,结果表明在池蝶蚌不同年龄的外套膜中,cam基因的表达是有变化的。以2龄池蝶蚌外套膜中cam基因的表达量为参照,4龄的表达量最高,其次是5龄的,1龄、2龄、3龄池蝶蚌外套膜中cam基因的表达没有显著差异。……   
[关键词]:池蝶蚌;外套膜;组织结构;钙调蛋白;CaM;基因克隆;荧光定量PCR
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南昌大学2008年
App内打开