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苹果醇酰基转移酶基因(MdAAT2)启动子克隆与功能鉴定

沈瑾

   酯类挥发性物质是构成苹果特征香气最重要的成份,目前针对醇酰基转移酶基因(MdAAT2)调控机理的研究,仅限于果实成熟过程中乙烯的调控作用及与果实品质的关系,而信号物质诱导该基因表达的调控机制尚未见报道。本文克隆了苹果醇酰基转移酶基因(MdAAT2)的启动子,并将其与GUS基因融合,通过农杆菌介导法转化烟草,对启动子进行了组织化学分析和调控分析,主要结果如下: 1.MdAAT2启动子序列的克隆 将金帅苹果叶片的基因组DNA稀释后做模板,利用tail-PCR得到725bp左右的特异产物。以725bp为模板,tail-PCR得到1032bp左右的特异产物。将725bp和1032bp序列拼接出1572bp的序列(基因银行注册号:EF459693)。以1572bp为模板,在编码区ATG的5′端上游设计特异引物,以基因组DNA为模板进行PCR反应,扩增出1201bp的特异产物。将扩增产物与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌。利用PCR和酶切鉴定阳性转化子。 2. MdAAT2启动子克隆片断的序列比对 把725bp和1032bp序列进行比对发现,在重合区域,除了5个碱基有所不同,其余完全吻合,因此得到了两段序列拼接以后的全序列1572bp。构建表达载体时,去除编码区扩增出1201bp启动子序列。将1572bp与1201bp比对,两段序列基本吻合,个别碱基有所不同。 3. MdAAT2启动子转录起始位点的确定 将cDNA序列与1201bp比对,得到转录起始位点为黑色方框中5′端第一个字母A。确定了转录起始位点,就可以对启动子序列进行标号,将转录起始位点标为+1,5′上游以负号表示。 4. MdAAT2启动子与GUS基因融合 引入300bp左右带有SpeI酶切位点的片段,将连有此片段的pMD载体和pBI载体用BamHI和HindIII酶切连接。这样,改造后的pBI121表达载体就引入了SpeI酶切位点。用BamHI和SpeI将长度为1201bp的MdAAT2启动子从克隆载体中切下,定向替换pBI121质粒的35S启动子,与GUS基因连接,获得MdAAT2启动子的植物双元表达载体,转化大肠杆菌,利用PCR和酶切鉴定阳性转化子,提取pBI质粒,转化农杆菌。 5.含有MdAAT2启动子转基因烟草的获得 将上述表达载体转化农杆菌,然后转化烟草。为了进一步鉴定抗卡那霉素烟草植株确实为转基因植株,提取转基因烟草叶片的基因组,根据pBI121载体中抗卡那霉素的基因设计专一引物,对转基因烟草进行PCR检测。PCR反应程序为:94℃,预变性5分钟;94℃,40秒;58℃,40秒;72℃,90秒;72℃,10分钟;共35个循环。 6. MdAAT2启动子的GUS定量分析和组织化学分析 取MdAAT2转基因烟草的根、茎、叶和花进行GUS染色和GUS定量活性分析,发现MdAAT2启动子可以高效驱动GUS基因在烟草的花器官中表达,而在叶、茎和根中几乎检测不到GUS活性。对烟草的花粉囊、花粉、柱头、胚乳、种子进行GUS染色分析,发现主要在花粉和花粉管中高效表达。分别用MeJA、SA和ETH处理转基因烟草结果相同,且处理后蓝色更深更明显。这说明MdAAT2启动子是花粉和花粉管特异表达启动子。 7. MdAAT2启动子的调控分析 利用PCR技术对1201bp启动子进行5′端有目的的缺失,分别扩增出783 bp、716 bp、370 bp和297bp的片段。用同样的方法进行3′端有目的的缺失,分别扩增出1039bp、681bp、259bp和227bp的片段。将所得PCR产物分别克隆到pMD18-T载体中,筛选阳性克隆,测序后发现所选的8个阳性克隆都含有MdAAT2启动子中的相应序列,分别构建植物表达载体。……   
[关键词]:苹果;MdAAT2;启动子克隆;功能鉴定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2009年