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乙型肝炎病毒X基因转染诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖及上调促炎因子表达的机制

卢宏柱

   第一部分乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建 目的:构建乙型肝炎病毒(HBV)X基因与pCI-neo相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物,以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列,将X基因连接到真核表达载体pCI-neo,构成pCI-neo-X质粒,然后用酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等方法,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因的功能奠定了基础。 第二部分乙型肝炎病毒X基因转染对大鼠肾小球系膜细胞增殖以及肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6表达的影响 目的探讨HBV X基因表达的蛋白(HBx)对体外培养的大鼠系膜细胞表达肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6及细胞增殖的影响。方法将前面构成的pCI-neo-X真核表达载体,采用脂质体法将pCI-neo-X转染给体外培养的大鼠系膜细胞,Westem blot测定HBx的表达;以半定量反转录(RT)-PCR测定体外培养大鼠系膜细胞TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6。甲基噻唑基四唑(MTT)法测定细胞增殖。结果转染pCI-neo-X的系膜细胞,HBx在36和48小时表达明显。同时半定量反转录PCR测定显示TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA表达量较未转染和转染空载体组明显增高。培养36和48小时后上清液中TNF-α水平在转染pCI-neo-X组、未转染和转染空载体组分别为(185.3±70.7)pg/ml,(41.7±10.3)pg/ml,(44.0±10.1)pg/ml,(140.3±42.1)pg/ml,(43.7±10.6)pg/ml,(33.3±8.6)pg/ml;IL-1β水平分别为(402±60)pg/ml,(182±23)pg/ml,(170±18)pg/ml,(432±58)pg/ml,(181±20)pg/ml,(165±19)pg/ml;IL-6水平分别为(177.0±18.2)pg/ml,(85.7±16.9)pg/ml,(69.7±22.2)pg/ml,(179.7±26.3)pg/ml,(70.0±18.3)pg/ml,(73.0±14.0)pg/ml,pCI-neo-X组与未转染和转染空载体组比较,均有显著性差异(p<0.05);细胞增殖在36和48小时pCI-neo-X组最明显,吸光度分别为1.56±0.36,1.69±0.32,与未转染组0.70±0.08,0.74±0.18和转染空载体组0.68±0.18,0.80±0.19比较,有显著差异(p<0.05)。 结论HBx可诱导大鼠系膜细胞高表达TNF-α、IL-1β和IL-6,促进系膜细胞增殖。HBx对系膜细胞的增殖作用可能与TNF-α、IL-1β、IL-6的高表达有关。 第三部分乙型肝炎病毒X蛋白通过激活核因子-κB和细胞外调节蛋白激酶上调大鼠系膜细胞表达肿瘤坏死因子-α 目的探讨HBV X基因转染大鼠系膜细胞导致细胞增殖及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)高表达的细胞外蛋白调节激酶(ERK)信号转导机制。方法将含有HBVX基因的质粒pCI-neo-X转染入体外培养的大鼠系膜细胞,MTT法检测系膜细胞增殖,半定量RT-PCR检测TNF-αmRNA表达,ELISA检测培养上清液中TNF-α表达。Western blot检测HBx、ERK_(1/2)及p-ERK_(1/2)表达。分别采用特异性抑制剂U0126阻断ERK_(1/2)通路,Lactacystin阻断NF-κB通路和SB203580阻断p38MAPK通路,观察培养细胞增殖、TNF-α及其mRNA表达,以不加抑制剂作为对照。结果转染pCI-neo-X后,系膜细胞增殖明显,细胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表达均增高,通过阻断ERK_(1/2)或NF-κB通路,系膜细胞增殖减弱,细胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表达均下降。而阻断p38MAPK通路对系膜细胞增殖,细胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表达无明显影响。结论转染HBV X基因可促使系膜细胞增殖,细胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表达均增高,这一作用可能部分是HBV X基因表达的蛋白通过激活ERK_(1/2)以及NF-κB通路信号而实现。而与p38MAPK通路无关。……