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油菜花粉超微粉有效成分溶出、代谢特征及指纹图谱研究

姚秋萍

   油菜花粉是一种丰富的花粉资源,具有提高免疫活性、降血脂、抗肿瘤等生物学功能。目前对油菜花粉的研究侧重于基础和应用研究,而对于深入系统的研究较少。本研究以油菜花粉为实验材料,采用超微粉碎技术使花粉破壁,以普通粉碎方式作为对照,对比了两种粉碎方式对所得的超微粉和细粉中主要营养成分、有效成分的影响,及组织形态学上的差异;比较油菜花粉超微粉、细粉中槲皮素和山奈酚在实验动物体内的药代动力学参数;对油菜花粉超微粉多糖进行分级,筛选抗氧化和免疫活性部位,对活性部位多糖进行结构表征;建立油菜花粉超微粉黄酮类成分的HPLC指纹图谱,使这一丰富资源的开发和应用提高到新的水平,主要结果如下: 1.分析比较了超微粉碎和普通粉碎方式对油菜花粉主要营养成分含量的影响,并比较了扫描电镜下超微粉和细粉形态学上的差异。结果表明:除粗纤维含量降低外,粗蛋白、粗脂肪、灰分、还原糖和总黄酮含量都有不同程度的提高。在电镜下观察,油菜花粉细粉基本可以看到完整的细胞形态,而超微粉的颗粒变小、大小均匀,绝大多数细胞壁破裂,基本无完整的细胞存在,破壁率为98.86% 2.分别采用高效液相色谱法、比色法分析比较了油菜花粉超微粉和细粉中黄酮类成分(槲皮素、山奈酚)、不同浸提时间下多糖的溶出差异。结果表明:在相同的提取条件下,油菜花粉超微粉中槲皮素和山奈酚的溶出率比细粉分别提高了45.16%和27.86%。油菜花粉超微粉多糖的溶出量和溶出速度都大于细粉,浸提时间为10min时多糖的溶出率较细粉提高了252.54%;红外光谱结果显示油菜花粉超微粉和细粉多糖的主要基团无明显差异。超微粉碎可显著提高油菜花粉有效成分的溶出率。 3.采用高效液相色谱法测定家兔灌胃给予油菜花粉超微粉和细粉后血浆中槲皮素和山奈酚的浓度,血药浓度-时间数据经药代动力学分析软件(PKS软件)处理,比较油菜花粉超微粉和细粉中槲皮素和山奈酚在家兔体内的药代动力学参数。结果表明:油菜花粉超微粉和细粉中槲皮素和山奈酚的药代动力学最佳模型均为二室开放模型。油菜花粉超微粉槲皮素的主要药动学参数:Ka=0.5793h~(-1), t1/2α=2.43h,t1/2β=18.33h,AUC0→∞=0.3613μg·L~(-1)·h,Vd =804.8 L·kg~(-1),Tpeak =2.5714h,Cmax=0.01908μg·mL~(-1);油菜花粉细粉槲皮素的主要药动学参数:Ka=1.2790h~(-1),t1/2α=2.63 h,t1/2β= 28.00h,AUC0→∞= 0.3411μg·L~(-1)·h,Vd = 997.3 L·kg~(-1),Tpeak =3.048 h , Cmax =0.018769μg·mL~(-1)。油菜花粉超微粉山奈酚的主要药动学参数: Ka=0.4136h~(-1), t1/2α=2.29h,t1/2β=2.97h,AUC0→∞=1.8897μg·L~(-1)·h,Vd =33.056L·kg~(-1),Tpeak =3.6429h,Cmax=0.28079μg·mL~(-1);油菜花粉细粉山奈酚的主要药动学参数:Ka=0.44362h~(-1) , t1/2α=1.74 h,t1/2β= 1.99h,AUC0→∞=1.4599μg·L~(-1)·h,Vd = 31.418 L·kg~(-1),Tpeak =3.7143 h,Cmax =0.24553μg·mL~(-1)。与细粉组比较,油菜花粉超微粉组血浆槲皮素和山奈酚的达峰时间缩短、达峰浓度提高,相对生物利用度较细粉分别提高了46.00%、29.44%。超微粉碎技术可提高油菜花粉有效成分槲皮素和山奈酚的生物利用度。 4.采用不同截留分子量(100kD、50kD和10kD)的超滤膜对油菜花粉超微粉粗多糖进行分级纯化,分析了压力和时间对超滤过程的影响,确定最适操作条件,3种截留分子量的超滤膜运行时间分别控制在28、36和48min以内,操作压力分别为1.1、1.3和1.6MPa。油菜花粉超微粉粗多糖M按分子量分成M1>100kD、50kD<M2<100kD、10kD<M3<50kD及M4<10kD 4个级别,所得多糖质量分布比例约为2.3∶1∶1.1∶1.6,并获得各段分子量的多糖制品纯度均高于68%。通过体外抗氧化、体内抗氧化和免疫活性试验相结合对分级的产物跟踪筛选活性组分。体外清除(·OH)和(O2-·)的试验结果表明,油菜花粉多糖的抗氧化活性与其分子量分布密切相关,M3、M4两个级分的抗氧化作用较低,在后续试验中合并作为一个组分M3进行研究。由体内抗氧化、免疫活性试验筛选得到高活性组分M2和低活性组分M3,M2级分多糖较其它组分有较好的抗氧化和免疫活性,各组分的抗氧化和免疫活性大小顺序为M2>M>M1>M3。 5. M2级分多糖先后经DEAE- SephadexA -25离子交换柱层析和Sephadex G~(-1)00凝胶柱层析纯化得到RPP1-2。经高效液相凝胶色谱鉴定其纯度及计算分子量,RPP1-2为单一对称峰,重均分子量为65358Da。离子色谱测定RPP1-2中-SO42-含量为2.81%。紫外光谱、红外光谱和核磁共振分析结果表明,RPP1-2为糖蛋白缀合物,为α-糖苷键构型,分子结构中存在α-(1,3)、α-(1,6)糖苷键,RPP1-2由3种不同单糖残基组成的杂多糖,糖链中重复单位包含葡萄糖、甘露糖和半乳糖。 6.采用高效液相色谱法对不同产地的油菜花粉超微粉的指纹图谱进行比较,应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件对油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC指纹图谱进行分析评价。以芦丁为内标物,采用Diamonsil C18柱(250×4.6 mm,5μm)为分析色谱柱,乙腈-0.4%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速0.8 mL·min~(-1),检测波长254 nm,柱温25℃。结果表明: 10批不同产地的油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC指纹图谱较相似,各成分得到较好的分离,并根据检测结果确定了10个共有指纹峰。该方法具有重现性好,特征性强,方法简便、快速等特点,能够客观反映油菜花粉超微粉的指纹特征,可以成为油菜花粉超微粉质量评价及控制的表征指标。……   
[关键词]:油菜花粉;超微粉碎;多糖;药代动力学;指纹图谱
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:福建农林大学2009年