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猪流行性腹泻病毒部分S基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

王萃瑜

   猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪对本病都易感,但对哺乳仔猪的危害最为严重,以仔猪呕吐、严重腹泻和脱水为主要临床特征。1周龄以内的哺乳仔猪于开始腹泻后2-4d死亡,致死率高达90%以上,给养猪业造成了严重的经济损失。目前,PED的诊断方法主要有病毒中和试验、免疫荧光法、免疫电镜法、ELISA和RT-PCR法等。随着分子生物学技术的不断发展,间接ELISA法以其敏感性高、特异性强越来越受到人们的重视。 对PEDV的研究表明,S基因编码的S蛋白是猪流行性腹泻病毒(PEDV)的主要的结构蛋白,是诱导机体产生中和抗体和提供黏膜免疫保护作用主要的结构蛋白。与GenBank上的其它毒株相比较发现S基因具有很高的保守性,所以重组S蛋白可作为理想的检测抗原用于临床PEDV。本试验为使S蛋白在原核细胞中得以表达,针对S基因的保守区设计并合成了一对扩增部分S基因的引物P_1,P_2,以pMD18-T-PS阳性克隆质粒为模板,扩增出目的片段S_1基因,片段大小约为500bp。同时采用不同的载体系统,探索了S基因的表达效果,即将猪流行性腹泻病毒的部分S基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a的Sal I和NotI之间的多克隆位点上,进而构建了重组原核表达质粒pGEX-6p-S_1和pET-32a-S_1。将重组表达质粒pGEX-6p-S_1和pET-32a-S_1,分别转化到宿主表达菌BL21(DE3)中,用终浓度为1mmol/L的IPTG对宿主表达菌诱导表达。经SDS-PAGE分析表达产物,结果表明:S_1基因在原核表达系统pGEX-6p-1和pET-32a中获得表达,表达的重组蛋白大小约为20KD。本实验选择表达量较高的pET-32a-S_1原核表达系统,对其进行包涵体提取纯化,得到纯度达90%以上的重组蛋白。Western blot检测表明,表达的重组蛋白能够被PEDV阳性血清所识别。由此说明,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。 将构建的含有猪流行性腹泻病毒部分S基因原核表达质粒pET-32a-S_1进行诱导表达之后,纯化重组蛋白包涵体,通过Western blot检测纯化后蛋白的反应原性。将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,建立可检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法。 利用已建立的ELISA方法对吉林省猪场进行血清学检测,检测100份临床血清样品,检出总阳性率为88%。试验结果表明,建立的间接ELISA方法敏感、特异,可用于临床PEDV血清抗体的检测。这为ELISA诊断试剂盒的研制开发奠定了基础,为建立规模化猪场PEDV感染的快速诊断方法提供了科学依据。……   
[关键词]:猪流行性腹泻病毒;S基因片段;原核表达;间接ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2008年