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流行性乙型脑炎病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及病毒特异性抗原表位鉴定

王斌

   流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)广泛分布于东亚和南亚,是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的严重的人畜共患传染病。乙型脑炎病毒的NS1蛋白参与病毒的RNA复制,能诱发机体在非中和性抗体存在的情况下产生保护性免疫,但目前它们的机制尚不清楚。乙型脑炎病毒与西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(Saint Louis encephalitis virus,SLEV)和墨累谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitisvirus,MVEV)同属一个血清群,这4种病毒有着极其相似的生物学特性,它们中的两种或多种常常在同一个地区流行,感染后导致相同或相似的临床症状。目前的鉴别诊断方法主要包括噬斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)、病毒分离、RT-PCR等,这些方法不但费时费力,而且对实验设备和人员具有一定要求,甚至需要生物安全3级实验室,显然这并不能满足流行病学调查中大规模样品检测和临床上快速诊断的需要,因此需要建立一种具有高度特异性的血清学诊断方法。 本研究首先将乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2株的NS1基因克隆到原核表达载体pET-30,重组质粒验证连接正确后转化大肠杆菌感受态细胞BL21,经IPTG诱导表达后,将表达产物纯化作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠;经过免疫、融合、筛选等过程,共获得4株特异性针对NS1蛋白的单克隆抗体,IFA表明其中3株能识别天然状态下的NS1蛋白。设计一套包含整个NS1蛋白的51个短肽片段,每个肽段长度为16aa,每两个相邻的短肽之间有8aa的重叠。为表达这些短肽,首先人工合成了表达它们的基因,在编码链的5 端引入BamHI位点,3 端引入XhoI位点。反义链与编码链互补,且退火后形成的双链DNA正向为BamHI粘性末端,反向为XhoI粘性末端,可直接与酶切线性化处理的pGEX-6P-1载体相连接;这51个肽段经IPTG诱导后得到了表达,表达产物与制备的单克隆抗体1H6作用,ELISA结果显示其中的第18(NS1-18)和第19(NS1-19)与单抗1H6呈现明显的阳性反应,而其他49个短肽为阴性反应,由此可以判定单抗1H6的抗原表位位于NS1-18和NS1-19的重叠区域(1819-0);将该区域逐一氨基酸截短表达后与单抗1H6反应,结果表明序列146EHRAW150为该表位的核心序列,Western blot表明该表位可被猪JEV阳性血清所识别。 在GenBank中选取39株基因全部测序的JEV,序列比对显示该表位在不同毒株之间高度保守,同源性为100%;选取西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(SaintLouis encephalitis virus,SLEV)、墨累谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitis virus,MVEV)、登革热病毒(DENV)、蜱传染性脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)和黄热病毒(Yellow Fever virus,YFV)共162株其他相关的黄病毒科病毒,将其NS1蛋白上的相关区域与该抗原表位进行序列比对,结果表明该抗原表位在不同黄病毒科病毒之间保守性差;为确定所鉴定表位的特异性,将这162株病毒NS1蛋白上与该抗原表位同源区域表达后与单抗1H6反应,结果显示所有其他病毒NS1蛋白的同源区域均不与单抗1H6反应,表明在本实验中所鉴定的表位为病毒特异性抗原表位。 本研究首次确定了位于乙型脑炎病毒NS1蛋白上的一个病毒特异性抗原表位,为建立一种方便、快捷、适用于现地大规模样品检测的鉴别诊断方法奠定了基础,同时也为乙型脑炎病毒新型亚单位疫苗的研制,以及研究病毒感染和机体免疫过程中NS1蛋白与宿主体内相应分子之间的相互作用提供了有用信息。……   
[关键词]:乙型脑炎病毒;非结构蛋白;单克隆抗体;表位;鉴别诊断
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2009年