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H3N2亚型猪流感及不同亚型流感重组病毒的拯救

杜金玲

   猪流感(Swine influenza,SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的一种急性高度接触性的群发性猪呼吸道疾病,猪流感一旦暴发,将会给养殖业造成巨大损失,尤其当与其它呼吸道疾病继发或混合感染,如猪繁殖与呼吸障碍综合征等(Porcine reproductive respiratory syndrome, PRRS),损失更是无法估量。猪具有同时感染禽、马和人流感病毒的能力,被认为是新的流感病毒产生的中间宿主和“基因混合器”。而且,猪流感病毒不需重组就有最大限度感染人的能力。因此,猪流感具有重要的兽医和人类公共卫生学意义。 本实验选用猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本毒,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术分别对病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,拯救出全部基因均来自于亲本株的猪流感病毒rgH3N2。电子显微镜观察rgH3N2可见病毒具有典型的流感病毒形态结构:病毒粒子呈圆形或椭圆形,直径在l00 nm左右,病毒有囊膜,囊膜上有纤突。生物学实验结果表明rgH3N2在鸡胚半数感染量(EID50)、组织培养半数感染量(TCID50)、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。rgH3N2经鸡胚一次鸡胚传代后血凝价为24,多次传代后血凝价最高可达到28。rgH3N2接种MDCK细胞60 h后,血凝价可以达到26。拯救病毒rgH3N2同亲本病毒一样,接种小鼠后,在小鼠体内各脏器均未分离到病毒。 分别以人流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、禽流感病毒A/Duck/Nanchang /4-165/2000 (H4N6 )、马流感病毒A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)的HA和NA基因替换猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)的相应基因,基因替换后,成功拯救出了重组病毒rgH1N1、rgH4N6和rgH3N8,经一次鸡胚传代后,血凝价分别可达到211、2 4、2 7,而且,三种重组病毒在鸡胚中连续传代稳定性良好,多次传代后,血凝价最高可达211、2 9、、2 10。同时,三株重组病毒在细胞上也均具有较高的增殖能力,接种MDCK细胞48 h后,rgH1N1血凝价即可达210、rgH4N6血凝价达为29;rgH3N8在接种MDCK细胞54 h后,血凝价达到了29。rgH1N1、rgH4N6和rgH3N8在鸡胚与细胞上的高增殖能力,为流感疫苗的生产奠定了基础。rgH3N8病毒接种小鼠后,仅在小鼠肺脏中分离到,病毒滴度最高可达211。 重组病毒的成功拯救及HA、NA基因的成功替换为流感病毒突破种间屏障分子机制、HA与NA基因在流感病毒跨种属传播中所扮演角色的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。……   
[关键词]:猪流感;反向遗传;RT-PCR;重组病毒;病毒拯救
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2009年