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人脐带血干细胞移植治疗糖尿病鼠下肢缺血的研究

杨耀国

   第一章脐带血CD34~+细胞的分离、培养、扩增和鉴定 目的本研究在比较羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll淋巴细胞分离液法制备脐带血单核细胞基础上,采用免疫磁珠分选人脐血CD34~+细胞,建立一种能够方便获得高纯度人脐~CD34~+细胞的方法;同时在体外培养扩增该细胞,扩增前后的细胞进行鉴定,进一步了解CD34~+细胞的特性,为其临床应用创造条件。 方法取足月妊娠、正常分娩的新鲜脐血,随机分配到实验组和对照组;实验组采用羟乙基淀粉法,对照组采用Ficoll淋巴细胞分离液法收集单个核细胞(MNC)。两组均使用MidiMACS免疫磁性吸附性分选装置,采用CD34~+细胞阳性正选法,进行CD34~+细胞的分选与纯化,之后应用包含干细胞因子(SCF),血小板生成素(TPO),粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的无血清培养液,进行7天体外培养扩增;在显微镜下动态观察细胞生长的情况,应用流式细胞仪检测扩增前后细胞CD34~+细胞的纯度和表面标志。 结果共采集脐血20份,实验组与对照组平均体积为110.2±25.2ml vs108.1±21.1ml,统计分析无显著性差异。实验组与对照组获得单核细胞数为(5.15±1.17)×10~9和(4.13±1.03)×10~9,虽然后者少于前者,但是两者相比统计学无显著性差异(p=0.053)。两组分离的CD34~+细胞数,实验组多于对照(6.25±1.11)×10~9和(4.04±0.66)×10~9,统计学分析有显著性意义(p<0.05)。Midi MACS分选的CD34~+细胞的纯度实验组为97.23±3.3%,对照组为96.23±2.3%,两组间统计学无显著性差异。两组细胞活力无差别,台盼蓝拒染细胞活力达96%以上。经过细胞因子培养后实验组扩增倍数为7.43±0.90,对照组扩增倍数为7.06±1.01,两组进行t检验无显著差异(p=0.403)。培养后的CD34~+细胞进行流式细胞仪鉴定,表明细胞表面CD133、CD117均有表达。 结论羟乙基淀粉结合免疫磁珠分选的方法在获得高纯度CD34~+细胞中有重要的意义。应用包含细胞生长因子的无血清培养液可以体外扩增CD34~+细胞。 第二章糖尿病裸鼠模型和下肢缺血模型的制备 目的通过高脂饮食和链脲佐菌素(STZ)腹腔注射结合制备BALB/C裸鼠糖尿病模型,观察其血糖及胰腺病理学改变;建立糖尿病裸鼠的下肢缺血模型,观察下肢缺血变化。 方法8—9周龄雄性BALB/C裸鼠,随机分为四组,Ⅰ组给予高脂饮食4周后注射链脲菌素(30mg/kg)共饲养8周(n=10),Ⅱ组普通饮食4周后注射链脲菌素(30mg/kg)共饲养8周(n=10),Ⅲ组高脂饮食8周(n=10),Ⅳ组正常对照组普通饮食4周后注射等量柠檬酸钠缓冲液(n=10)。其中Ⅰ组和Ⅳ组在8周后制作下肢缺血模型。测定小鼠血脂、血糖、糖耐量,制作胰腺切片,观察其形态学变化;选取Ⅰ组和Ⅳ组裸鼠,游离左下肢股动脉及大隐动脉、旋髂外动脉及股动脉肌支共四处,分别用3/0号线结扎后切断,并且将下肢主干动脉包括胫腓动脉予以抽剥,制作下肢缺血模型,观察肢体血运,温度,病理等变化。 结果注射STZ 4周后Ⅰ组裸鼠血糖、总胆固醇均显著高于空白组;形态学观察发现,Ⅰ组胰腺病理HE染色可见胰岛淀粉样沉积、散在分布、形状不规则,对照组未出现类似变化。制作成功下肢缺血模型后观察,在糖尿病组肢体缺血情况重,坏死范围多,非糖尿病组多是局限于脚趾的坏死,缺血下肢皮肤的颜色较健康侧加深,坏死范围没有糖尿病组大。糖尿病组小鼠下肢缺血自我恢复慢,两组从第7天开始就出现差别,统计分析7天、14天和28天的时候糖尿病组血流恢复慢,两组间采用重复测量的方差分析检验有显著性差异p<0.05。HE染色普通光学显微镜下检查可见正常裸鼠的骨骼肌肌纤维排列整齐,肌节清晰可见;Ⅳ组裸鼠骨骼肌肌纤维排列较紊乱,肌间质部分纤维化,Ⅰ组即糖尿病组的紊乱更加明显,肌肉萎缩,肌间质部分纤维化。 结论高脂饮食和STZ腹腔注射结合可用于糖尿病鼠模型的制作,与人类2型糖尿病代谢特征相似,是研究人类糖尿病血管病变较理想的动物模型。在糖尿病模型基础上制作下肢无主干及其分支动脉供血的缺血模型,更接近于重症下肢缺血的临床实际情况。 第三章脐带血干细胞移植治疗糖尿病鼠下肢缺血研究 目的研究经过培养扩增的脐带血干细胞移植入糖尿病性下肢缺血模型裸鼠肢体后对缺血恢复的促进作用;研究TGF-β1和CD105在干细胞移植中的变化及意义。 方法分离脐带血CD34~+细胞,进行体外培养,并且制备糖尿病裸鼠下肢缺血模型;用Dil标记培养后的干细胞和单核细胞;动物分组:Ⅰ组移植经过培养的CD34~+的脐带血干细胞(n=10),Ⅱ组移植从脐带血分离的单核细胞(n=10),Ⅲ组注射相同体积的PBS+0.1%BSA(n=10);在细胞培养7天后,将6.68×10~5/个细胞注射到缺血肢体,此时为缺血模型制作成功后3天;采用激光多普勒血流灌注测量移植前,移植后3、7、14、28天检测三组温度变化,免疫组化检侧毛细血管密度。在移植后12小时和28天时每组分别取5只进行实时定量逆转录—多聚酶链反应(RT-PCR)和Western blotting检测TGF—β1和CD105在细胞移植后的变化。 结果经过标记的细胞在Ⅰ组中可以观察到,移植细胞聚集在肌束周围。Ⅲ组中没有发现标记细胞,Ⅱ组中有少量标记的移植细胞发现。从第14天开始,Ⅰ组的温度恢复明显好于Ⅱ组和Ⅲ组,统计学分析有显著性差异p<0.05。在Ⅰ组血管密度明显增多。Ⅱ组亦有新生血管,密度大于Ⅲ组,明显小于Ⅰ组,Ⅲ组中血管密度改变较小。Ⅰ组中有人源的单克隆抗体HNA表达。细胞移植后12小时,TGF—β1 mRNA和CD105mRNAⅠ组高于Ⅱ组和Ⅲ组,Ⅱ组和Ⅲ组相比,前者较后者有增高,均有统计学意义(p<0.05),28天时各组间无明显差异。Western blotting检测移植后12小时TGFβ1和CD105蛋白,Ⅰ组明显高于Ⅱ组和Ⅲ组,Ⅱ组高于Ⅲ组,差异有显著性(p<0.05)。28天,检测TGFβ1和CD105蛋白的变化发现,Ⅰ组TGF—β1明显高于Ⅱ组和Ⅲ组,统计学分析有显著性差异(p<0.05),Ⅱ组和Ⅲ组相比,统计学分析无显著性差异。 结论移植培养扩增的脐带血干细胞可以改善糖尿病裸鼠缺血局部的皮温、增加缺血局部的血管密度、促进缺血恢复;缺血组织中TGF—β1和CD105的表达增高可能对缺血恢复有重要作用。……   
[关键词]:脐带血;CD34;扩增;糖尿病;动物模型;缺血;干细胞;脐带血;缺血
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国协和医科大学2009年