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嗜铬细胞瘤新诊断方法的建立以及SGL-3、SGL-1治疗心力衰竭的药理学研究

刘哲

   背景嗜铬细胞瘤是一种多发于肾上腺髓质的罕见肿瘤,如不能及时诊断治疗常会导致严重的突发心血管疾病甚至死亡。传统的嗜铬细胞瘤生化诊断方法均存在准确性不高等问题,变肾上腺素类物质(包括变肾上腺素和变去甲肾上腺素)是目前国际公认的嗜铬细胞瘤的首选检测指标。而据了解,国内目前还没有建立24小时尿变肾上腺素类物质的检测方法。本研究的目的是运用高效液相色谱仪建立24h尿变肾上腺素类物质的检测方法,从可靠性和准确性等方面考察此方法在嗜铬细胞瘤诊断中的应用价值,确立其诊断标准和正常值范围,并通过与儿茶酚胺检测结果的比较验证变肾上腺素类物质在嗜铬细胞瘤诊断中的优越性。 方法首先通过加热使结合型变肾上腺素类物质转化为游离型变肾上腺素类物质,然后使用固相萃取柱进行提取,蒸干重溶后采用高效液相色谱-电化学法进行检测。通过测定仪器变异、批内变异、批间变异和回收率来考察方法的稳定性。然后用此方法对324例高血压非嗜铬细胞瘤患者(对照组)和7例嗜铬细胞瘤患者(病例组)进行了变肾上腺素类物质的检查,运用受试者工作曲线确定诊断标准,用百分位法确定正常值范围。同时对部分病例的血浆儿茶酚胺或24h尿儿茶酚胺进行了检测。 结果①变肾上腺素、变去甲肾上腺素的出峰时间均不超过10分钟;②变肾上腺素的仪器变异、组内变异、批间变异和回收率分别为2.3%、5.5%、5.1%、93.4%;变去甲肾上腺素的仪器变异、组内变异、批间变异和回收率分别为1.9%、4.8%、4.7%、87.9%;③对照组的变肾上腺素检测值为152±114μg/24h,变去甲肾上腺素检测值为294±267μg/24h,病例组的变肾上腺素检测值为1426±1956μg/24h,变去甲肾上腺素检测值为4376±2591μg/24h;④变肾上腺素的诊断标准为415μg/24h,99%正常值范围上限为419μg/24h,变去甲肾上腺素的诊断标准为1464μ∥24h,99%正常值范围上限为1184μg/24h;⑤变肾上腺素诊断的灵敏度为71.4%,特异度为98.8%,变去甲肾上腺素诊断的灵敏度为100%,特异度为100%,血浆去甲肾上腺素诊断的灵敏度为71.4%,特异度为79.0%,24小时尿去甲肾上腺素诊断的灵敏度为100%,特异度为82.4%。 结论本研究建立了快速、稳定、准确的24小时尿变肾上腺素类物质的检测方法,并在国内首次确立了其诊断标准和正常值范围;相比血浆、尿儿茶酚胺等检测指标,变肾上腺素类物质是目前临床检验嗜铬细胞瘤的最佳指标。 背景在过去的几十年中,尽管人们对充血性心力衰竭的认识逐渐加深,治疗手段和治疗效果也有了明显改善,但心衰患者的发病率和死亡率依然居高不下,开发新的心衰治疗药物仍具有重要而迫切的临床意义。SGL-3是一个传统中药组方,经长期临床应用证明对心力衰竭具有显著的改善作用。本研究的目的之一即通过体内、体外实验验证SGL-3对心力衰竭的治疗效果,并初步探讨其作用机制。SGL-1是一个黄酮类化合物单体,经前期实验证明具有强抗氧化性,而在心力衰竭尤其是过量应用抗癌药物阿霉素导致的心脏毒性中,活性氧的产生是最重要的作用机理,因此,本研究的另一目的是通过体外实验验证SGL-1对阿霉素所致心脏毒性的改善作用,为进一步研究SGL-1在治疗心力衰竭中的应用和机理打下基础。 方法①SGL-3体外实验。采用Angiotensin-Ⅱ(1μmol/L)刺激原代培养的乳鼠心肌细胞引起心肌细胞的肥大,通过H~3掺入实验和鬼笔环肽染色观察SGL-3(10μg/mL)对心肌细胞肥大的抑制作用。②SGL-3体内试验。采用20周龄雄性Wistar大鼠,对大鼠进行腹主动脉缩窄手术(AAC)或假手术,20周后,通过超声心动图检测确定术后大鼠出现的心脏功能异常。之后将动物分组,灌胃给药,SGL-3的给药浓度为:150 mg·kg~(-1)·d~(-1)、500 mg·kg~(-1)·d~(-1)和1,500 mg·kg~(-1)·d~(-1),同时设置对照组,即卡托普利(270 mg·kg~(-1)·d~(-1))与倍他乐克(1,800 mg·kg~(-1)·d~(-1))合用组,给药18周。然后使用多导生理仪和超声心动图检测不同组大鼠的射血分数(EF)等心脏血流动力学和形态学参数,采用苏木素—伊红染色、masson染色及天狼猩红染色进行了病理学检查,并通过高效液相色谱和放免法测定大鼠肾素—血管紧张素—醛固酮系统和心房利钠肽(ANP)血浆浓度的变化。③SGL-1体外实验。采用噻唑蓝、Hoechst33258染色法观察SGL-1的抗细胞凋亡作用,检测乳酸脱氢酶以量化SGL-1的抗细胞损伤作用,检测活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性评价SGL-1的抗氧化作用,并通过噻唑蓝染色法考察了SGL-1对阿霉素抗肿瘤活性的影响。 结果①SGL-3可以显著抑制Angiotensin-Ⅱ刺激引起的心肌细胞肥大,通过H~3掺入实验可观察到蛋白合成量显著下降(减少74%±26%),通过鬼笔环肽染色可观察到细胞表面积显著减少(下降104%±31%)。②体内实验结果显示,SGL-3能够改善心脏的收缩功能(AAC组EF值为51.8%±8.42%,假手术组EF值为75.6%±7.65%,SGL-3治疗组EF值为69.3%±7.73%,卡托普利与倍他乐克合用组的EF值为56.3%±8.41%)。病理学检查则发现SGL-3能够明显抑制AAC引起的心肌细胞肥大、心肌纤维化。通过高效液相色谱和放免法测定,发现肾素—血管紧张素—醛固酮系统和ANP血浆浓度均有一定程度的改善(与模型组相比,p<0.05)。 ③SGL-1可以显著减轻阿霉素引起的细胞凋亡(82.8%vs.48.8%)和细胞损伤(1.83倍vs.1.23倍),清除活性氧,降低丙二醛浓度(2.5倍vs.1.46倍),使超氧化物歧化酶(58.9%vs.89.3%)、谷胱甘肽过氧化物酶(46.1%vs.87.3%)活性恢复至接近正常水平,并且不影响阿霉素的抗肿瘤活性(30.9%vs.29.5%)。 结论①SGL-3可以减轻心肌细胞肥大,抑制心肌肥厚向心力衰竭发展的进程。其机制可能与SGL-3改善心功能,抑制后负荷增高引起的肾素—血管紧张素—醛固酮系统激活有关。②SGL-1可以显著减轻阿霉素引起的心肌细胞凋亡和损伤,其机制与SGL-1清除活性氧,改善细胞内氧化应激状态有关。……