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苏云金芽胞杆菌杀虫基因的鉴定与克隆

谢月霞

   苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前应用最广泛的生防微生物。由于害虫抗性的产生,杀虫谱窄等问题的存在,苏云金芽胞杆菌新型基因的克隆将为拓宽我国Bt杀虫基因的种类,扩大杀虫对象,特别是发现对较难防治的害虫有效的基因,为培育抗虫转基因植物提供有效的基因资源,也为害虫的抗性治理提供一种方法。本研究采用PCR-RFLP技术对本实验室分离保存的285株Bt菌株进行了基因型的鉴定:结果表明这些菌株含有cry1,cry2,cry3,cry4/10,cry8,cry9, cry11,cry21,cry22,cry30,cry32,cry40和vip3A共13类基因。56株含有cry1型基因,45株含有cry2型基因,97株含有cry8型基因,13株含有cry32型基因,10株含有cry4/10型基因,9株含有cry30型基因,5株含有cry22型基因,含有cry11和cry3型基因的菌株各2株,含有cry9,cry21和cry40型基因的菌株各1株;有39株含有vip3A型基因;106株未鉴定出基因型,这些菌株有可能含有未知的基因型,有待于进一步研究。在基因组合方面,有12株含有cry8C和cry8F,5株含有cry8E和cry8F基因;发现有5株同时含有cry1Aa,cry1Ea,cry1Be,cry1Ah,cry1Ai,cry1Ic,cry2Ab和vip3Aa共8种基因,杀虫活性也有待于进一步研究。 伴胞晶体的SDS-PAGE分析结果表明:同时含有cry1和cry2型基因的菌株大部分表达约130kDa、60kDa的晶体蛋白,晶体形状多为菱形;含有cry22基因的菌株编码约80kDa蛋白,晶体为大圆形,且晶体较芽胞大;含有cry32基因的菌株多表达约130 kDa、40kDa的晶体蛋白,晶体形状为菱形;含有cry8基因的菌株大部分表达约130kDa的蛋白条带,晶体形状几乎都为球形。未鉴定出基因型的菌株表达的晶体蛋白多样,晶体形状也具有多样性。 从菌株FZ-4中克隆了全长cry22基因。菌株FZ-4中克隆得到的全长cry22基因已在GenBank中登记,登录号为EU715020,并被Bt基因国际命名委员会正式定名为cry22Aa3,是一种新的cry22基因,在国内首次发现。 通过对cry4和cry32基因部分序列的克隆与测序,发现了4个新基因。菌株FBG-133和FZ-2各含有一个新的cry32基因,菌株FBG-133克隆的部分基因序列与GenBank中已知的Bt模式基因cry32Ca1(AB075461.1)的序列相似性最高,相似性为86%;菌株FZ-2中克隆的部分基因序列与Bt模式基因cry32Aa1(AY008143.1)的序列相似性最高,相似性为91%。菌株FBG-25经克隆得到1563 bp的部分基因序列,这部分基因序列只与已知的cry模式基因cry54Aa1(EU339367)具有序列相似性,相似性为97%。菌株FPT-3经克隆得到1418bp的部分基因序列,通过NCBI BLAST分析发现,克隆得到的部分基因序列与GenBank中已知的Bt基因不存在相似性,推断含有未知的基因,有待于进一步研究。 97株含有cry8基因的菌株中有3株对大黑鳃金龟幼虫活性较高,这3株菌分别为菌株Hw-11、FBG-74和FBG-17,LC50分别为1.0716×108芽胞/mL菌液、3.6109×108芽胞/mL菌液和11.5792×108芽胞/mL菌液;有44株对铜绿丽金龟幼虫活性较高,其中菌株FPT-38和Hw-2对铜绿丽金龟的活性最高,14d校正死亡率可以达到100%。106株未鉴定出基因型的菌株对铜绿丽金龟、大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟、小菜蛾和棉铃虫活性较低或者没有活性,这些菌株需通过扩大供试昆虫的种类来发现它们的杀虫活性。……   
[关键词]:苏云金芽胞杆菌;PCR-RFLP;SDS-PAGE;基因;克隆
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2009年