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真核生物翻译起始因子eIF5A溶液结构研究

袁金桥

   真核生物翻译起始因子5A(eIF5A)是一个分子量约18 kDa的酸性蛋白,其序列从古细菌到哺乳动物高度保守,并广泛存在于各种真核生物细胞中。eIF5A是迄今为止唯一一种已知含有特殊氨基酸残基hypusine的蛋白质。hypusine是一种蛋白翻译后修饰产物,它的形成对eIF5A的功能完整至关重要,相关的研究结果表明hypsine在控制细胞周期循环的过程当中扮演着一个重要的角色。在过去30年对eIF5A进行的一系列研究中,人们发现eIF5A具有广泛的功能。尽管eIF5A可能参与诸多细胞生理过程,但其具体生物学功能及其hypusine修饰的生物学意义并不十分清楚。 我们中心细胞生物学实验室进行的研究结果表明,eIF5A可能是p53的一个调控因子。而且进一步的研究发现,另一个含两个PDZ结构域的蛋白-syntenin可以通过影响eIF5A和p53的信号转导通路来调控p53的水平,从而影响细胞凋亡。为了研究eIF5A与syntenin以及其他蛋白之间的相互作用,进而获得更多eIF5A结构和功能之间的关系,我们利用核磁共振技术解析了人eIF5A的溶液结构并结合其结构特点对功能进行了初步探讨。 我们首先克隆、表达和纯化了15N和15N/13C标记的人的eIF5A蛋白,并利用MADLI-TOF-MS等方法进行了鉴定。二维1 H- 15N HSQC核磁共振谱图结果显示eIF5A的蛋白状态适合于用核磁共振方法进行结构研究。之后,我们通过优化缓冲液中盐的浓度和pH值以及调整核磁共振实验温度等参数确定了三共振实验条件,并采集了一系列三维核磁共振谱图,包括用于主、侧链谱峰指认的HNCO、HNCA、HN(CO)CA、HNCBCA、CBCA(CO)NH、HBHA(CO)NH、HCC(CO)NH、CC(CO)NH、HCCH-COSY、HCCH-TOCSY等实验,以及用于收集距离约束的3D 15 N-编辑NOESY-HSQC和3D 13C-编辑NOESY-HSQC。然后,我们采用Cyana和Amber等软件通过一系列的结构计算和结构优化,最终解析了人eIF5A的溶液结构。此外,为了确定eIF5A两个结构域的相对取向,我们还测定了蛋白质的残余偶极耦合常数。 在我们解析的人的eIF5A的溶液结构中,可以看到eIF5A由结构域Ⅰ和结构域Ⅱ组成,且每个结构域都由多个反平行的β-折叠片组成,这两个结构域通过一个活动的铰链连接而成整个蛋白的构象。此外,从结构上看,序列上hypusine所在的位置是一个突出的灵活的环,这个环连接了N端结构域上的两个β-折叠片。 对已报道的古细菌eIF5A的晶体结构结构进行比对分析发现,这些三维结构和我们解析的结构具有非常相似的特征。但我们解析的人的eIF5A的溶液结构与其他同源结构相比有一个很重要的不同:即在人的eIF5A的溶液结构的结构域Ⅱ中,有两个β-折叠片是通过一个α-螺旋连接的,而在古细菌的蛋白中不含有α-螺旋。结构域Ⅱ中多样的残基序列,并且加上有一个在古细菌中没有的α-螺旋结构单元,这可能都反映了eIF5A在结构和功能上的进化。已有报道显示eIF5A独立的结构域Ⅱ能和syntenin反应,这也在一定程度上验证了eIF5A结构域Ⅱ的结构特点。……   
[关键词]:真核生物翻译起始因子;核磁共振;溶液结构;功能;残余偶极耦合
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军事医学科学院2008年