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抗人CD28单链抗体基因在Sf9细胞及家蚕中的表达研究

黄光镁

   鼠源性单抗在人体使用后可产生人抗鼠抗体(Human Anti-Mouse Antibody, HAMA)反应,而且分子量大,不能有效进入病灶部位,临床使用受到限制。单链抗体(single chain Fv, ScFv)是由一条连接肽将IgG分子的重链和轻链的可变区连接而成的,减少了免疫原性,分子小,实体组织穿透力强,血浆半衰期短,因而在临床疾病的诊断和治疗中具有重要的应用价值。 将抗人CD28的鼠源单链抗体基因(mouse anti-human CD28 ScFv )亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTa中,得到重组转移载体pFastBacHTa-ScFv转化大肠杆菌DH10Bac,获得重组杆粒rBacmid-ScFv。脂质体介导转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒rBV-ScFv。将该重组病毒感染Sf9细胞, SDS-PAGE和Weatern blot分析表明:抗人CD28 ScFv在昆虫细胞中获得高效表达,分子量约36 kDa。细胞裂解及产物可溶性分析表明:该单链抗体基因在Sf9细胞中超高量表达并以不溶性集聚体形式存在,表达产物可达细胞总蛋白的25.7%。经变性溶解集聚体、Ni-NTA亲和层析,获得纯化抗人CD28 ScFv表达产物。流式细胞分析,当CD28 SvFc结合了T-28细胞表面抗原结合表位后,单克隆抗体2F5与T-28细胞的结合率从86.9%下降至18.1%,表明抗人CD28 ScFv可有效地与CD28单克隆抗体竞争性结合CD28细胞表面抗原。 HyNPV是BmNPV和AcNPV通过基因重组后得到的一个具有BmNPV和AcNPV双重优点的新型杂交病毒,本研究还利用家蚕-HyNPV表达系统,研究了其在家蚕中的表达。 本研究在成功拼接抗人CD28单链抗体基因的基础上,应用二种Bac-to-Bac BEVS系统构建并获得了抗人CD28-ScFv的转移载体和重组病毒,并在Sf9细胞和家蚕中表达了CD28-ScFv,首次对Sf9细胞中表达的外源蛋白抗CD28 ScFv的可溶性问题进行了研究,获得了具有免疫学活性的高纯度的抗人CD28单链抗体。为抗CD28 ScFv的抗肿瘤药物的开发奠定了基础。……   
[关键词]:CD28;ScFv;Bac-to-Bac表达系统;可溶化;家蚕
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:苏州大学2009年