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马铃薯生料糖化发酵转化乙醇的研究

苏小军

   我国是世界上最大的马铃薯生产国,种植面积达8000万亩,产量超过8000万吨。尽管生产占据第一位,但加工业却很薄弱,严重制约了整个产业的发展。以马铃薯为原料生产乙醇可为我国马铃薯的深加工开辟一条新途径。乙醇通过进一步的纯化,即可成为食用乙醇,也可用作工业乙醇,还可成为燃料乙醇。随着全球性能源安全问题的出现,以马铃薯为原料生产燃料乙醇是最有发展前景的。 目前,能耗较大和成本偏高是制约乙醇产业发展的主要问题,因此,有关乙醇生产的研究也主要集中在这两方面。以淀粉质为原料发酵生产乙醇,传统工艺必须先通过高温高压蒸煮工序,而该蒸煮工序消耗的能量占到了整个生产过程总能耗的30%-40%。生料发酵技术省去了高温蒸煮糊化工艺,避免了高温条件下可发酵性糖的损失,因而具有降低能耗、简化操作工序、降低生产成本等优点,但目前其工业化应用受到了菌株产酶活力低、酶活力不稳定、发酵周期长、效率低、容易污染等因素的限制。生料发酵技术的关键在于生淀粉的水解糖化,因此通过选育生淀粉酶高产菌株和提高淀粉对酶解的敏感性等途径来增加生淀粉的糖化效率,是当前的研究重点和热点。 本文以马铃薯为对象,开展生料糖化发酵技术转化乙醇的研究。一方面通过选育马铃薯生淀粉酶高产菌株,并通过产酶条件的优化,获得高活力生淀粉酶,以达到实现生料糖化发酵转化乙醇的目的。另一方面,采用辐照技术对马铃薯原料进行预处理,以提高糖化效率,并通过进一步的条件优化,实现马铃薯生料发酵转化乙醇。本研究旨在建立起以马铃薯为原料转化乙醇新技术体系,为解决我国马铃薯加工产业问题提供新思路,为乙醇产业发展开辟原料新途径提供技术支持,对于我国马铃薯和乙醇产业乃至能源的可持续发展都有重要意义。取得研究结果如下: 1、通过从马铃薯加工基地、酒精厂和淀粉厂附近的腐殖土壤及腐烂马铃薯中广泛取样,初步筛选出了10株具有较强马铃薯生淀粉糖化能力的菌株,并通过进一步筛选,获得了1株对马铃薯生淀粉糖化能力相对较强的菌株,其液体培养所产的生淀粉酶活力达30.5 U/ml,固体培养所产生淀粉酶的活力达19.3U/ml。对菌株的形态学研究和ITS rDNA序列同源性比较分析表明,该菌株属于黑曲霉(Aspergillus niger)。 2、采用紫外辐照和硝基胍处理相结合的方法对上述菌株进行了诱变,得到1株产酶能力大大提高的突变株,其固体发酵所产生淀粉酶的酶活力为43.8U/ml,比出发菌株提高了127%。经连续6代传代试验验证,该突变株的遗传性能稳定。为方便起见,将该突变菌株命名为Aspergillus niger AF-1。 3、对菌株AF-1固态发酵所产生淀粉酶的酶学性质分析表明,酶的最适反应温度为55℃,在60℃以下稳定,具有一定的耐热能力;最适反应pH为4.0,在pH 3.5-5.0范围内稳定,为一种酸性酶;Mn~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Ba~(2+)对酶有一定的激活作用,而Cu~(2+)、K~+、Na~+则抑制酶的活性。酶对底物的作用方式表现出多样性,以表面扩散侵蚀的方式作用于马铃薯和木薯生淀粉,以表面扩散侵蚀和形成大侵蚀孔洞的方式同时作用于红薯淀粉。 4、利用响应面法对菌株AF-1固态发酵产生淀粉酶的条件进行了优化。首先采用单因素试验筛选出马铃薯粉、豆粕粉、FeSO_4为最适碳源、氮源和无机盐。然后通过Plackett-Burman设计对影响产酶条件的12个相关因素进行效应评价,筛选出具有显著效应的豆粕粉、温度和麸皮三个因素。再利用最陡爬坡试验逼近以上三个因素的最大响应区域。最后采用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,得出豆粕粉含量、温度和麸皮添加量的最佳值分别为11.46%、26.26℃和17.41g。优化后的酶活提高到204 u/ml,比初始酶活提高了3.85倍。 5、采用γ射线对马铃薯进行辐照处理,发现马铃薯淀粉经50-400kGy剂量照射后原有颗粒形貌并没有改变,但经200kGy剂量处理后溶于水6h颗粒表面出现明显裂痕,经400kGy剂量处理后溶于水3h颗粒表面出现大量裂痕,6h颗粒失去原有形貌。进一步的分析表明,马铃薯粉经不同剂量辐照处理后,溶解度增加,其中以400kGy剂量处理增加效果最显著,溶解度达61%,比对照的提高了4倍;辐照处理具有直接糖化效果,还原糖的含量随着辐照剂量的加大而增加,其中以400kGy剂量辐照处理的糖化效果最明显,DE值达5.1%;马铃薯经辐照处理后,对酶的作用变得敏感,且随着辐照剂量的增加而加强;200kGy剂量范围内辐照处理对糖化效率的提高不如95℃蒸煮显著,但400kGy剂量辐照处理的要远远高于蒸煮的;离子色谱法分析检测表明,马铃薯粉经200、400kGy剂量辐照处理后,降解产物主要为葡萄糖和麦芽糖;经400kGy辐照处理后酶解产物主要为葡萄糖,酶解的主要产物单一。 6、以生马铃薯粉为原料,采用酵母菌和菌株Aspergillus niger AF-1所产生淀粉酶进行同步糖化发酵转化乙醇时,合适的酶添加量为150U/g,料水比为1:2.5,酵母添加量为5×10~7个/ml。另外,添加外源氮源硫酸铵能够提高发酵液的乙醇浓度。Ca~(2+)、Mg~(2+)对发酵有一定的促进作用,分别在8mmol/L和4mmol/L浓度条件下表现出最大效应。50kGy剂量辐照处理对生淀粉酶和酵母菌同步糖化发酵产乙醇的影响不大;100kGy剂量辐照处理对发酵有一定的促进效果;200kGy、400kGy剂量辐照处理的促进效果最显著,发酵液最终的乙醇浓度均达到11%。 7、50kGy、100kGy剂量辐照处理对商品糖化酶和酵母菌同步糖化发酵产乙醇的影响不大;200kGy剂量辐照处理对发酵有一定的促进效果,但不是很显著;400kGy剂量辐照处理的促进效果最强烈,发酵液最终的乙醇浓度可达10.1%。采用单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面分析相结合的试验方法对经400kGy剂量辐照处理后的马铃薯生料商品酶和酵母菌同步糖化发酵产乙醇的工艺条件进行了优化,优化条件下发酵液的乙醇浓度可达12.4%,较优化前提高了22.8%。通过条件优化研究,将马铃薯生料发酵生产乙醇的最佳条件确定为:温度35.27℃、料水比1:2.07、pH4.0、装瓶量125ml、(NH_4)_2SO_4 0.2%、接种量2.5×10~7个/ml、糖化酶200U/g、淀粉酶15U/g、纤维素酶10U/g、发酵周期48h。……   
[关键词]:马铃薯;生料;乙醇;黑曲霉;生淀粉酶;同步糖化发酵;辐照
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:湖南农业大学2009年